研究目的环烯醚萜类化合物是一类在天然界中广泛存在的次生代谢产物,具有多种生物学活性,临床用于阿尔茨海默病、抑郁症以及心血管等疾病的治疗。目前研究认为,这些疾病的发生与机体内氧化应激水平有着密切的关系。氧化应激是指机体内氧化-还原体系失衡,产生过剩的不能被身体消除的自由基(ROS或RNS)。细胞内过量的ROS会诱发多种疾病。本文通过研究环烯醚萜类化合物降低机体氧化应激作用,探讨此类化合物的活性作用机制及其构效关系,对于环烯醚萜类化合物的活性研究及新药开发都具有重要意义。本文以环烯醚萜成分的氧化应激活性为中心,选取了栀 梔子苷、胡黄连苷Ⅱ、马钱苷、缬草三酯、乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯等6种活性较强且具有代表性的化合物进行研究。通过结构确证、抗氧化能力分析、肿瘤细胞杀伤作用和神经细胞保护作用,研究化合物的活性差异,探讨该类化合物的作用机理及其构效的相互关系。研究方法1.环烯醚萜苷和酯类化合物结构的确定和体外抗氧化能力分析(1)乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯是同分异构体,其结构在文献中存在混淆情况。实验通过 UV、IR、MS 和1H-NMR、13C-NMR 和二维 NMR(HMQC 和 HMBC谱)进行分析,对乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯的结构进行全归属。(2)采用铁离子还原抗氧化力(Ferric reducing antioxidantpower,FRAP)、羟自由基(Hydroxyl free radical,OH·)、超氧阴离子(Superoxide anion,O-·)清除力、ABTS+·清除力和DPPH·的清除能力实验,研究栀子苷、胡黄连苷Ⅱ、马钱苷、缬草三酯、乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯6种化合物自由基清除能力。2.环烯醚萜苷和酯类化合物促进肿瘤细胞调亡的可能机制选择不同的肿瘤细胞模型:人肝癌细胞(Human liver carcinoma cells,HepG2)、人宫颈癌细胞(human cervix carcinoma cells,HeLa)和人乳腺癌细胞(human breast cancer cells,MDA-MB-231),及正常细胞系人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),采用MTT法对活细胞生存率进行分析。采用Annexin V-FITC/PI双标标记调亡细胞,通过流式细胞术检测HepG2细胞早期调亡和晚期调亡的细胞数量,并通过监测细胞内DCF荧光变化,分析给药前后细胞内ROS浓度变化,分析化合物是否是通过降低细胞内ROS浓度而表现出肿瘤细胞杀伤作用。3.环烯醚萜苷和酯类化合物神经细胞保护的可能机制选择已分化的PC12细胞系模拟神经细胞,用不同浓度和时间H202损伤PC12细胞建立神经细胞氧化损伤模型。通过MTT法对H202损伤的PC12细胞生存率进行分析,确定最适损伤浓度和时间。将实验分为空白组,模型组和给药挽救组,通过MTT法比较模型组和给药挽救组细胞生存率差异,分析不同化合物的挽救效果。采用Annexin V-FITC/PI双标标记调亡细胞,通过流式细胞术检测早期调亡和晚期调亡的细胞数量化合物的挽救效果,并通过监测细胞内DCF荧光变化,分析给药挽救前后细胞内ROS水平,分析化合物是否能通过降低损伤细胞内ROS浓度起到神经细胞保护作用。4.蜘蛛香及啤酒花缬草提取物片(制剂)的活性研究,与单体化合物活性比较为明确蜘蛛香药材及其制剂中抗氧化应激的物质基础,实验选择蜘蛛香药材(2批次)和制剂(3批次)进行研究,首先采用LC-MS对药材及制剂的极性和非极性成分进行分析,采用对照品比对和MS解析,确定药材和制剂的主要成分。通过挽救H202损伤PC12细胞模型研究药材和制剂对细胞的挽救效率。通过含量折算,分析缬草三酯、乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯与药材、制剂之间的量效关系。5.缬草环烯醚萜类成分的强制降解实验及其降解前后抗氧化应激活性比较研究通过强制降解实验:酸性条件(0.01MHCl,25℃,5h),碱性条件(O.O1MNaOH,25 ℃,10 min),氧化条件(3%～6%H202,25℃,24h),加热条件(甲醇溶液60℃,0,1,2,4,或6 h;固体4℃,7天;固体25 ℃,7天)和光照条件(强度5000 lx,3 h)。分析缬草环烯醚萜的可能降解规律,通过DPPH·-TLC-MS、LC-MS分析,对环烯醚萜热降解产物的结构进行推断;通过ABTS+·清除力、DPPH·的清除能力、肿瘤细胞杀伤实验对抗氧化能力和肿瘤细胞杀伤作用、促进细胞调亡能力和降低细胞ROS水平进行检测,从而分析环烯醚萜酯类化合物结构与活性之间的关系。研究结果1.乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯是同分异构体,差异仅为一个乙酰基团连接位置不同。通过HMBC图谱解析可以发现,与乙酰基相连的羰基碳会向高场移动,通过全谱归属(乙酰缬草三酯:δC 171.2(C-13),169.8(C-16),170.4(C-22)和 170.8(C-2’);1-β乙酰缬草三酯:δC 171.2(C-13),171.6(C-16),167.6(C-22)和170.9(C-2’)),本文确定了乙酰缬草三酯和1-β乙酰缬草三酯的结构。通过体外清除自由基能力分析可知,胡黄连苷Ⅱ具有较强的自由基清除能力,这可能其结构中的酚羟基和三元氧环结构有关系。环烯醚萜酯类化合物清除自由基能力次之,栀子苷和马钱苷在自由基清除能力中未表现出清除自由基能力。2.在肿瘤细胞杀伤实验中,环烯醚萜苷类化合物对实验中的肿瘤细胞无明显杀伤作用,在高浓度时还具有促进细胞生长的作用。环烯醚萜酯类化合物对肿瘤细胞具有明显细胞毒作用,实验表明环烯醚蔽酯类化合物可通过降低细胞内ROS水平促进HepG2细胞凋亡。对HepG2细胞的杀伤作用依次为:缬草三酯>乙酰缬草三酯>1-β乙酰缬草三酯。3.实验采用80 μM H202处理PC12细胞12 h(细胞生存率下降至空白对照组50%以下)作为模型组。通过加入不同浓度和环烯醚萜苷和酯类化合物挽救48小时进行比较,与模型组相比,给药组细胞存活率均显著上升,凋亡率显著下降,细胞内ROS水平也显著下降。其中,栀子苷对H202损伤PC12细胞挽救效果最佳(在给药浓度为10 mM时,挽救率为17.5%),马钱苷和胡黄连苷Ⅱ作用次之(在给药浓度为20 mM时,挽救率分别为16.3%和12.9%),缬草环烯醚萜酯类化合物挽救效果较环烯醚萜苷类化合物弱,在给药75mM时挽救效率在(11.5,15.5)%。对PC 12细胞修复作用:栀子苷>马钱苷>胡黄连苷Ⅱ>缬草三酯类化合物。4.蜘蛛香药材(提取物或制剂)与单体化合物的活性相当,表明缬草环烯醚萜酯类化合物是蜘蛛香药材及制剂的主要活性成分。缬草环烯醚萜酯类化合物、药材、制剂均可通过降低细胞内ROS水平对损伤的PC12细胞进行保护。5.通过强制降解实验可知,缬草环烯醚萜类成分对于酸碱和甲醇溶液加热不稳定。在酸碱条件下,降解产物以酯键断裂为主,且反应剧烈不易控制;在甲醇溶液加热条件下,降解产物以三元氧环开环结构为主。在对热降解产物进行自由基清除实验和肿瘤细胞杀伤实验中发现,降解产物具有一定活性,但较原化合物活性下降明显,表明三元氧环是缬草环烯醚萜酯类化合物活性的重要结构基团。结论环烯醚萜苷和酯类成分具有较强生物学活性,推断环烯醚萜母核(半缩醛-烯醚环戊烷)是重要结构基础,抗氧化应激是其作用的重要途径之一。环烯醚萜酯可通过抗氧化应激起到肿瘤细胞杀伤作用。环烯醚萜酯是缬草及其制剂抗氧化活性的重要物质基础。三元氧环是缬草环烯醚萜酯类化合物抗氧化应激的重要结构基团。推断环烯醚蔽苷和酯类化合物可通过抗氧化应激起到神经细胞保护作用。