低温保存可减缓细胞代谢,延长其体外存活时间,是生物人工肝存储和运输的理想方式。但低温保存过程易引发细胞损伤,制约了生物人工肝的临床应用。因此,设计合适的保护策略以抑制低温保存中的细胞损伤,是确保生物人工肝广泛应用的重要基础。本论文基于微型化的中空纤维型生物人工肝,通过对低温保存保护剂的筛选、保护剂作用机理及低温损伤机理的研究,并结合保护剂在反应器内的传质分析,提出生物人工肝低温保存的新方法。通过对低温保存保护剂筛选发现,甘草酸二铵、维生素E、海藻糖和苦参碱对细胞具有显著保护作用。低温保存中的微型化生物人工肝经这四种保护剂联合处理后,其细胞活率和胞内谷胱甘肽水平与未经保护剂处理相比,分别提高了约38%和32%。随后,对作用机理已知的保护剂进行归纳总结可知,预培养阶段发挥功效的保护剂主要为抗氧化剂,低温阶段主要为细胞膜保护剂和线粒体膜通透性转变抑制剂,而复温阶段主要为抗氧化剂、线粒体钙离子通道阻滞剂和线粒体膜通透性转变抑制剂。同时,采用1,6-二磷酸果糖提高胞内ATP含量后仍不能阻止细胞损伤的发生,证明了ATP缺失不是引发低温损伤的初始诱因。此外,经研究发现,双鼠李糖脂在低温阶段通过增加细胞膜的通透性,促进细胞对海藻糖的吸收。而苦参碱在复温阶段主要通过抑制胞内游离钙离子的增加来减缓细胞损伤的发生。综合各保护剂作用机理及其作用阶段,初步说明了细胞低温损伤机理为：低温引发胞内氧化还原失衡、细胞骨架和线粒体膜电位受损,这些损伤在复温阶段进一步恶化,并伴随复温引发的胞内游离钙离子大量积累,导致了细胞损伤的加剧。另一方面,为探索保护剂在反应器内的传质规律,改进生物人工肝的传质研究手段,本论文还建立了基于微电极的中空纤维反应器扩散系数检测方法,获得了保护剂在反应器内扩散达平衡时间,并由此优化了各保护剂添加时间。结果显示,海藻糖需提前至预培养结束前0.75 h加入,才能在低温阶段发挥其保护效果,维生素E、苦参碱和甘草酸二铵需分别提前至低温结束前4.58 h、1.38 h和0.88 h加入,才能保证在复温瞬间发挥其保护功效。经保护剂添加时间优化后的保护策略,与优化前相比,分别提高细胞活率及胞内谷胱甘肽含量约17%和14%。随后,在低温阶段加入生物表面活性剂-双鼠李糖脂,使得复温后的细胞活率进一步提高约20%。采用优化后的保护策略将微型化生物人工肝低温保存36 h再复温144h后,与未经低温保存细胞相比,其活率维持约87%,尿素分泌、白蛋白合成和胞内GSH含量维持80-92%,而CYP 1A2和CYP 2E1活性维持80-86%。这些指标均好于现有文献报道,可满足生物人工肝临床应用的需要。该保护剂组合同样能显著抑制超低温保存中的肝细胞损伤,从侧面验证了保护剂的功效。总之,本论文通过对低温保存保护剂筛选,并结合保护剂作用机理、细胞低温损伤机理以及保护剂传质规律的研究,综合优化了低温保存的保护策略,建立了较理想的生物人工肝低温保存新方法,从而解决了生物人工肝的低温保存难题,并有助于提高对低温保存的理论认识水平。同时,微电极检测方法的建立也为生物人工肝的传质研究提供了新工具。