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流感病毒属于正粘病毒科负链RNA病毒,根据其核蛋白的抗原性分为甲型(A)、乙型(B)、丙型(C)、丁型(D)这四型流感病毒,其中甲型(A)流感病毒的易突变性很容易导致流感的大规模流行,使得其成为最严重的临床呼吸道疾病,严重危害全球公共卫生安全。由于流感病毒的高突变性与重组性,使得其能够逃避现有的治疗和预防手段,因此,发展新的有效预防和治疗措施变得尤为重要。流感病毒在感染过程中与宿主发生复杂的相互作用,一方面病毒利用宿主细胞实现其增殖,引发宿主病理反应,同时宿主也会产生抗病毒反应。microRNA(miRNA)是一类长度为19-26个核苷酸的单链非编码RNA,能够特异性地结合到靶基因的3’UTR区,导致靶mRNA的降解或抑制其翻译。miRNA作为一种重要的调节因子,广泛地参与细胞的发育分化、癌症的发生发展以及病毒的感染等多种生理和病理过程中。目前已有文献报道流感病毒与miRNA之间的关系,但是由于使用的实验材料和实验方法不同,实验结果存在诸多矛盾,并且miRNA分子种类众多,因此仍需要大量的数据积累。本课题选取两株不同亚型的A型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1N1/BJ501)和A/goose/jilin/hb/2003(H5N1/JH)进行实验。首先,我们在病毒感染细胞后发现细胞因子IFNβ、CCL2、TNFα及病毒NP的表达水平均上调,证实了这两株病毒能够有效感染A549细胞。然后,通过miRNA芯片筛选和qPCR验证发现4个8 h和24 h均差异表达的mi RNA:miR-141、miR-200c、miR-21-3p和miR-29b-1-5p,其中miR-141和mi R-200c上调,而miR-21-3p和miR-29b-1-5p下调,并且H5N1调控幅度强于H1N1。由于一些miRNA能够被灭活病毒和病毒模拟物非特异性地调节。我们通过UV灭活的病毒和ploy(I:C)来刺激细胞,结果表明,灭活病毒和ploy(I:C)对这4个miRNA并没有明显的调节作用,揭示了这些miRNA的差异表达与流感病毒的复制直接相关。随后,我们采用生物信息学手段预测mi R-141、miR-200c、miR-21-3p和miR-29b-1-5p的靶基因,通过GO和Pathway分析表明这些miRNA的靶基因广泛地参与到多种生物学过程中,如MAPK信号通路、Wnt信号通路等,在流感病毒感染复制过程中发挥着重要作用。既然流感病毒能够调节miRNA的表达,那么反过来这些miRNA能否影响流感病毒的复制呢?我们先对miR-21-3p的功能进行研究。双荧光素酶报告基因实验结果发现miR-21-3p能够靶向抑制8个基因的3’UTR,其中miR-21-3p对HDAC8的3’UTR抑制作用最强。进一步结果显示miR-21-3p能够在mRNA和蛋白水平同时抑制HDAC8的表达,这些结果充分证实了HDAC8是miR-21-3p直接作用的靶基因。随后,miR-21-3p mimic和inhibitor等实验结果表明miR-21-3p能够促进流感病毒的复制。进一步HDAC8 siRNA实验结果显示敲低HDAC8同样能够促进流感病毒的复制,与过表达miR-21-3p的结果相似,揭示了miR-21-3p通过抑制HDAC8来促进流感病毒的复制,至少是部分通过HDAC8途径来实现的。因此推测流感病毒感染过程中miR-21-3p表达下调可能是宿主细胞抵抗流感病毒感染的一种机制。我们又对miR-141和miR-200c的功能进行研究。首先,双荧光素酶报告基因实验揭示了流感病毒能够在转录水平诱导miR-141和miR-200c的表达。其次,我们发现miR-141能够靶向抑制3个基因的3’UTR,miR-200c能够靶向抑制7个基因的3’UTR。其中,HDAC4的3’UTR能够被miR-141和miR-200c共同抑制,而miR-200c对XIAP的3’UTR抑制作用最显著。进一步结果证实了XIAP是miR-200c直接作用的靶基因,而HDAC4是miR-141和miR-200c共同靶基因,同时我们发现流感病毒直接抑制XIAP和HDAC4蛋白的表达。随后,miRNA mimic和inhibitor等实验结果表明miR-200c能够抑制流感病毒的复制,但是miR-141对流感病毒的复制并没有显著影响。进一步XIAP siRNA实验结果显示敲低HDAC8只能够抑制H5N1的复制,而对H1N1的复制没有显著影响,这与过表达mi R-200c的结果不完全一致,说明miR-200c对H1N1复制的抑制并不是完全通过靶向XIAP来实现的。虽然miR-200c与miR-21-3p的变化趋势不同,但同样是宿主细胞对抗流感病毒感染的一种机制,宿主细胞被病毒感染时可能通过对自身多种miRNA的调节来实现抑制病毒的目的。综上所述,我们的研究揭示了宿主细胞能够通过miR-200c上调和miR-21-3p下调这两个途径来抵抗流感病毒H1N1和H5N1的感染,这将为预防和控制流感病毒的传播提供一个新的切入点。