背景与目的大量研究表明，心肌缺血、缺血再灌注损伤、心脏重塑等心血管疾病的病理进程中可产生较多氧自由基，大量的氧自由基可引起心肌细胞氧化应激损伤，造成细胞器受损、DNA断裂、细胞膜破损，最终导致心肌细胞坏死和凋亡，心肌细胞大量的坏死和凋亡又进一步加重疾病的严重程度，形成恶性循环。坏死常常发生在心肌缺血晚期，而凋亡则贯穿众多心血管疾病的整个病程，因此减轻心肌细胞氧化应激损伤，减少心肌细胞凋亡对临床心血管疾病的治疗具有重要的意义。MicroRNAs (miRNAs)于1993年在线虫体内首次被发现，是一类长度约为18-25nt的单链非编码小分子RNA，其作为多靶点调控的上游调控因子，越来越受到人们的关注。目前已有多种miRNAs在动植物体内被发现，其通过抑制靶基因mRNA的翻译过程，参与细胞增殖、分化与凋亡等的调节；与个体发育、机体代谢以及多种疾病的发生发展密切相关。已有研究证明miRNAs能够调控多种心血管疾病的发生发展，如miR-133a, miR-26和miR-221调控心肌缺血引起的心脏重构、心衰、心肌纤维化等，但相关miRNA调控氧化应激损伤引起的心肌细胞凋亡的研究罕见报道。本研究采用不同浓度H2O2处理H9c2心肌细胞，选择最佳H2O2浓度建立心肌细胞凋亡模型，慢病毒转染miR-24，探讨miR-24对H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响及分子机制。针对以上实验设计，本课题拟进行如下研究：（1）体外培养H9c2心肌细胞，采用不同浓度H2O2处理H9c2心肌细胞，MTT法检测不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞增殖活性的影响，计算抑制率，筛选最佳H2O2浓度，建立心肌细胞凋亡模型（2）采用慢病毒转染方法上调H9c2心肌细胞中miR-24水平，探讨miR-24对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响。（3）检测转染miR-24后其靶基因E2F1的表达情况，探讨miR-24对H2O2诱导的心肌细胞凋亡调控的分子机制。为揭示miR-24在H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡中的调控作用提供实验依据。方法（1）不同浓度H2O2（25、50、100、200、400μmol/L）作用于H9c2心肌细胞，MTT法检测细胞增殖活性，计算抑制率，选择细胞增殖抑制率50%左右时的H2O2浓度建立心肌细胞凋亡模型。构建miR-24慢病毒及阴性对照载体，转染H9c2心肌细胞，倒置荧光显微镜下估算转染率，实时荧光定量PCR检测miR-24及E2F1的表达水平，验证转染效果。（2）将H9c2心肌细胞分为正常对照组(NC组)、H2O2组、转染慢病毒阴性对照+H2O2组（LV-GFP+H2O2组）、转染miR-24+H2O2组（LV-miR-24-GFP+H2O2组）。（3）FITC-AnnexinV/PI双染流式细胞术检测各组H9c2心肌细胞凋亡情况。（4）采用2-ΔΔCT实时荧光定量PCR方法（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）定量测定各组H9c2心肌细胞miR-24及E2F1mRNA的表达水平。采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，定量资料用均数±标准差（x±s）表示，正态分布的两组数据采用独立样本t检验，正态分布的两组以上数据采用方差分析，非正态分布数据采用非参数检验，显著水准α=0.05。结果1不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞增殖活性的影响:MTT法检测不同浓度H2O2对细胞增殖活性的影响，细胞增殖抑制率（IR%）=1-处理组平均吸光度值/对照组平均吸光度值。25、50、100、200、400μmol/L H2O2分别处理H9c2心肌细胞6h，结果显示，随着过氧化氢浓度的增加，对H9c2心肌细胞的抑制率越大，细胞凋亡的越多；过氧化氢的浓度为200μmol/L时，细胞增殖抑制率约为55%，因此采用200μmol/L的过氧化氢制作H9c2心肌细胞凋亡模型。2慢病毒表达载体的构建及转染：LV-miR-24-GFP及LV-GFP慢病毒表达载体的构建由上海吉凯基因化学公司完成，获得的慢病毒以1×109TU/mI共40μL即4×l07TU的病毒数进行H9c2心肌细胞转染。转染72h后荧光显微镜下观察GFP绿色荧光，细胞转染效率均达80%以上，实时荧光定量PCR检测转染LV-miR-24-GFP、LV-GFP慢病毒的细胞及未转染细胞miR-24的表达水平分别为（12.88±0.75vs3.16±1.01vs3.23±0.89），E2F1mRNA的表达水平分别为（4.11±0.77vs6.29±0.98vs6.70±1.04），差异均有统计学意义（P＜0.05），转染成功。3各组H9c2心肌细胞凋亡水平比较：（1）流式细胞术结果显示， H2O2组与NC组比较细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。（2）LV-miR-24-GFP+H2O2组与LV-GFP+H2O2及H2O2组比较细胞凋亡率显著降低(P＜0.05)。4各组H9c2心肌细胞miR-24及E2F1mRNA表达水平比较：（1）H2O2组与NC组miR-24的表达量分别为（0.70±0.24vs3.23±0.89），差异具有统计学意义（P＜0.05）；E2F1mRNA的表达量分别为（11.12±1.81vs6.70±1.04），差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）LV-miR-24-GFP+H2O2组、LV-GFP+H2O组及H2O2组miR-24的表达量分别为（2.25±1.24vs0.72±0.12vs0.70±0.24），差异具有统计学意义（P＜0.05）；E2F1的表达量分别为（8.30±1.04vs11.24±1.78vs11.12±1.81），差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论（1）H2O2可诱导H9c2心肌细胞凋亡。（2）经H2O2处理的H9c2心肌细胞中，miR-24表达明显减低，其靶基因E2F1表达升高。（3）慢病毒转染miR-24可抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡，此作用机制可能是通过靶向抑制E2F1基因实现的。