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背景与目的大量研究表明,心肌缺血、缺血再灌注损伤、心脏重塑等心血管疾病的病理进程中可产生较多氧自由基,大量的氧自由基可引起心肌细胞氧化应激损伤,造成细胞器受损、DNA断裂、细胞膜破损,最终导致心肌细胞坏死和凋亡,心肌细胞大量的坏死和凋亡又进一步加重疾病的严重程度,形成恶性循环。坏死常常发生在心肌缺血晚期,而凋亡则贯穿众多心血管疾病的整个病程,因此减轻心肌细胞氧化应激损伤,减少心肌细胞凋亡对临床心血管疾病的治疗具有重要的意义。MicroRNAs (miRNAs)于1993年在线虫体内首次被发现,是一类长度约为18-25nt的单链非编码小分子RNA,其作为多靶点调控的上游调控因子,越来越受到人们的关注。目前已有多种miRNAs在动植物体内被发现,其通过抑制靶基因mRNA的翻译过程,参与细胞增殖、分化与凋亡等的调节;与个体发育、机体代谢以及多种疾病的发生发展密切相关。已有研究证明miRNAs能够调控多种心血管疾病的发生发展,如miR-133a, miR-26和miR-221调控心肌缺血引起的心脏重构、心衰、心肌纤维化等,但相关miRNA调控氧化应激损伤引起的心肌细胞凋亡的研究罕见报道。本研究采用不同浓度H2O2处理H9c2心肌细胞,选择最佳H2O2浓度建立心肌细胞凋亡模型,慢病毒转染miR-24,探讨miR-24对H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响及分子机制。针对以上实验设计,本课题拟进行如下研究:(1)体外培养H9c2心肌细胞,采用不同浓度H2O2处理H9c2心肌细胞,MTT法检测不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞增殖活性的影响,计算抑制率,筛选最佳H2O2浓度,建立心肌细胞凋亡模型(2)采用慢病毒转染方法上调H9c2心肌细胞中miR-24水平,探讨miR-24对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响。(3)检测转染miR-24后其靶基因E2F1的表达情况,探讨miR-24对H2O2诱导的心肌细胞凋亡调控的分子机制。为揭示miR-24在H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡中的调控作用提供实验依据。方法(1)不同浓度H2O2(25、50、100、200、400μmol/L)作用于H9c2心肌细胞,MTT法检测细胞增殖活性,计算抑制率,选择细胞增殖抑制率50%左右时的H2O2浓度建立心肌细胞凋亡模型。构建miR-24慢病毒及阴性对照载体,转染H9c2心肌细胞,倒置荧光显微镜下估算转染率,实时荧光定量PCR检测miR-24及E2F1的表达水平,验证转染效果。(2)将H9c2心肌细胞分为正常对照组(NC组)、H2O2组、转染慢病毒阴性对照+H2O2组(LV-GFP+H2O2组)、转染miR-24+H2O2组(LV-miR-24-GFP+H2O2组)。(3)FITC-AnnexinV/PI双染流式细胞术检测各组H9c2心肌细胞凋亡情况。(4)采用2-ΔΔCT实时荧光定量PCR方法(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)定量测定各组H9c2心肌细胞miR-24及E2F1mRNA的表达水平。采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,定量资料用均数±标准差(x±s)表示,正态分布的两组数据采用独立样本t检验,正态分布的两组以上数据采用方差分析,非正态分布数据采用非参数检验,显著水准α=0.05。结果1不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞增殖活性的影响:MTT法检测不同浓度H2O2对细胞增殖活性的影响,细胞增殖抑制率(IR%)=1-处理组平均吸光度值/对照组平均吸光度值。25、50、100、200、400μmol/L H2O2分别处理H9c2心肌细胞6h,结果显示,随着过氧化氢浓度的增加,对H9c2心肌细胞的抑制率越大,细胞凋亡的越多;过氧化氢的浓度为200μmol/L时,细胞增殖抑制率约为55%,因此采用200μmol/L的过氧化氢制作H9c2心肌细胞凋亡模型。2慢病毒表达载体的构建及转染:LV-miR-24-GFP及LV-GFP慢病毒表达载体的构建由上海吉凯基因化学公司完成,获得的慢病毒以1×109TU/mI共40μL即4×l07TU的病毒数进行H9c2心肌细胞转染。转染72h后荧光显微镜下观察GFP绿色荧光,细胞转染效率均达80%以上,实时荧光定量PCR检测转染LV-miR-24-GFP、LV-GFP慢病毒的细胞及未转染细胞miR-24的表达水平分别为(12.88±0.75vs3.16±1.01vs3.23±0.89),E2F1mRNA的表达水平分别为(4.11±0.77vs6.29±0.98vs6.70±1.04),差异均有统计学意义(P<0.05),转染成功。3各组H9c2心肌细胞凋亡水平比较:(1)流式细胞术结果显示, H2O2组与NC组比较细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。(2)LV-miR-24-GFP+H2O2组与LV-GFP+H2O2及H2O2组比较细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。4各组H9c2心肌细胞miR-24及E2F1mRNA表达水平比较:(1)H2O2组与NC组miR-24的表达量分别为(0.70±0.24vs3.23±0.89),差异具有统计学意义(P<0.05);E2F1mRNA的表达量分别为(11.12±1.81vs6.70±1.04),差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)LV-miR-24-GFP+H2O2组、LV-GFP+H2O组及H2O2组miR-24的表达量分别为(2.25±1.24vs0.72±0.12vs0.70±0.24),差异具有统计学意义(P<0.05);E2F1的表达量分别为(8.30±1.04vs11.24±1.78vs11.12±1.81),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论(1)H2O2可诱导H9c2心肌细胞凋亡。(2)经H2O2处理的H9c2心肌细胞中,miR-24表达明显减低,其靶基因E2F1表达升高。(3)慢病毒转染miR-24可抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡,此作用机制可能是通过靶向抑制E2F1基因实现的。