瓣膜置换术是治疗各种心脏瓣膜疾病的唯一有效手段。目前临床应用的人工瓣膜主要是机械瓣和生物瓣,其中生物瓣的应用越来越广泛,在西方国家有的已超过机械瓣的用量。主要原因是机械瓣的终生抗凝治疗及其抗凝并发症导致的远期效果与生物瓣没有明显差别。而生物瓣只需术后短期抗凝治疗,且有较好的仿生血流动力学特点,术后并发症较少。但是生物瓣钙化、耐久性差的问题是不容忽视的。目前认为,生物瓣钙化可能与瓣膜基质的丢失及戊二醛的作用,机械应力造成生物瓣损伤,宿主钙磷代谢影响,炎症和免疫反应等因素有关。针对这一问题,国内外众多实验室都在寻求解决的方法,但结果均不理想。而在组织工程瓣膜的研究中,对生物原性的瓣膜材料进行去细胞处理后所获得的去细胞瓣膜支架材料,由于去除了细胞成分,完整保存细胞外基质,具有较低的免疫原性和钙化潜能,为瓣膜的抗钙化处理指出了一条新的径路。但去细胞处理后的瓣膜尚需进一步处理,以增强其力学强度和耐久性能。本研究拟选取经去细胞处理的猪主动脉瓣膜为基础材料,应用一种新型的生物源性交联剂-----原青花素交联处理,构建新型去细胞生物瓣,并通过体外、体内试验,检测原青花素处理去细胞瓣膜的生物学、理化、抗钙化性能及组织、细胞相容性,为改进生物瓣交联处理方法做新的探索。第一部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜的构建及生物物理性能评价。取回新鲜猪主动脉瓣膜,按本实验室建立方法经去细胞处理后,检测其去细胞效果,进而经0.1%原花青素交联处理后,检测原花青素去细胞瓣膜的厚度、组织含水量、热皱缩温度、可溶性蛋白含量、断裂强度、耐久性、抗酶解性能、交联度等生物生物物理性能,并与新鲜未去细胞瓣膜、去细胞瓣膜、戊二醛交联去细胞瓣膜比较。结果显示:去细胞效果满意,细胞成分去除彻底,纤维支架保存完整;原花青素去细胞瓣膜组厚度(0.15±0.04)mm、含水量(89.1±3.4)%、热皱缩温度(71±4.1)℃,与未去细胞组(0.16±0.07)mm、(88.7±4.7)%、(74±2.9)℃,单纯去细胞组(0.18±0.11)mm、(90.3±4.3)%、(73.3±5.1)℃均无明显差别(p>0.05),而与戊二醛处理组(0.27±0.08)mm、(75.1±3.9)%、(87.4±4.3)℃差别显著(p<0.05);而原花青素去细胞瓣膜组可溶性蛋白含量(0.71±0.22)%,与未去细胞组(2.16±0.32)%、单纯去细胞组(1.47±0.27)%均差别显著(p<0.05),而与戊二醛处理组(0.76±0.16)%无明显差别(p>0.05);原花青素去细胞瓣膜组断裂强度(11.8±0.91)mPa较其余各组(8.71±1.12)mPa、(8.25±1.07)mPa、(9.15±0.97)mPa均明显增强;耐久性实验发现原花青素处理组在PBS保存45天后断裂强度无明显变化;24h抗酶解实验可见新鲜瓣膜组及去细胞瓣膜组至2h已几乎全部降解,失重率接近100%,而降解24h后,原花青素去细胞瓣膜组和戊二醛处理组失重率分别为(10.21±1.8)%、(7.17±1.1)%,两组间亦未见明显差异。由上可知,原花青素处理去细胞瓣膜,在去除细胞成分及钙结晶核、降低免疫原性的同时,保持了完整的瓣膜构型和结构特点,具有较好的力学性能和生物学特性。第二部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜生物相容性评价。进行原花青素去细胞瓣膜原花青素释放试验,并通过L929细胞直接、间接接触细胞毒性实验考察原花青素生物相容性。结果提示:处理后1d原花青素释放到达高峰,浓度为798.32±52.31 ug/ml,至4d后原花青素释放浓度下降至7.31±1.12 ug/ml,尔后再无明显释放;间接接触细胞毒性实验提示不同时相的细胞毒性分级均为0-1级;直接接触细胞毒性实验中光镜及扫描电镜结果可见L929细胞贴壁生长,形态良好,随时间延长,细胞数量增加,在各观察点,实验组和空白对照组细胞形态及数量均无明显差别。由上可知,原花青素处理去细胞猪主动脉瓣细胞毒性低,生物相容性好,成纤维细胞能够在其表面良好生长。第三部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜抗钙化性能评价。通过大鼠皮下包埋实验,在1、2、3、4、6、8、10、12周提取标本,进行大体观察、组织切片HE染色、Masson染色观察组织相容性,并行Von-Kossa染色、扫描电镜-能谱分析检测各组材料抗钙化性能。结果提示包埋2w后组织炎症反应轻微,材料保存完好;Von-Kossa染色提示包埋21d单纯去细胞组可见轻度钙化,戊二醛处理组出现明显钙化,原花青素处理组未见钙盐沉积;包埋63d,单纯去细胞组钙化程度明显加重,戊二醛处理组钙化明显,原花青素处理组仍未见明显钙盐沉积;扫描电镜-能谱分析结果显示:包埋21d,单纯去细胞组未见钙峰出现,戊二醛处理组出现明显钙峰,原花青素处理组未见钙峰出现;包埋63d,单纯去细胞组出现少量钙峰,戊二醛处理组钙峰较前进一步增多、增高,原花青素处理组仍未见明显钙峰出现。由上提示,原花青素处理去细胞瓣具有良好的组织相容性和抗钙化性能。第四部分:原花青素交联处理去细胞猪主动脉瓣膜人骨髓间充质干细胞种植实验。经分离、纯化、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞,选取3-5代2×106cm-2种植于原花青素去细胞瓣膜,观察人骨髓间充质干细胞在原花青素去细胞猪主动脉瓣的生长情况。结果提示:所获得的细胞经流式细胞仪检测,所培养的细胞不表达CD34,高表达CD44,CD44阳性率在(92.12±2.34) %,与平行对照组(3.57±1.16) %比较有显著性差异(P<0.01)。免疫组化鉴定,MSCs具有特征性的表面标志,不表达CD34,而CD44表达强阳性。种植细胞后HE染色光镜观察,种植3天瓣膜表面单层细胞覆盖,细胞具有活性。种植7天,可见瓣膜表面覆盖细胞层明显增厚,多层细胞生长,具有活性,并有细胞分泌的细胞外基质。细胞未有向瓣膜深层生长趋势,瓣膜基质完整。扫描电镜观察可见,种植7天,瓣膜表面细胞均匀覆盖。种植14天后,瓣膜表面覆盖细胞层明显增厚,多层细胞生长。由上可知,原花青素瓣膜能够提供细胞生长的微环境,而且细胞能够发挥正常的生理功能。说明原花青素瓣膜具有良好的细胞相容性,且具有能够在体外快速内皮化的特性。通过以上实验,初步揭示了原花青素交联去细胞瓣具有良好的生物学特性,较低的免疫原性、细胞毒性,具有良好的组织相容性和抗钙化性能,并且具有能够在体外快速内皮化的特性,明显优于戊二醛处理效果,对进一步改进生物瓣抗钙化性能及耐久性有良好的发展前景,为原花青素交联生物瓣处理方法的深入研究做了初步探讨。