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研究背景白术是常用的益气健脾中药,也是益气健脾著名方剂四君子汤、参苓白术散、补中益气汤等的组成药物。临床上益气健脾中药有胃肠粘膜损伤修复作用,胃肠粘膜保护是其重要的作用靶点。细胞迁移是胃肠粘膜损伤修复的重要环节,本课题组研究发现,白术糖提取物能促进小肠上皮(IEC-6)细胞迁移,逆转DFMO(多胺合成抑制剂)所致的细胞迁移抑制,作用机制与影响多胺介导钾通道激活信号通路有关。实验结果对探讨白术促进胃肠粘膜损伤修复的作用机制有较好参考价值,但受试药均为未经纯化的白术粗多糖提取物,成分复杂,化学成分尚未分离和表征。本论文对白术多糖提取物进行分离纯化,观察其对IEC-6细胞迁移的影响,研究白术多糖调节细胞迁移活性的药效物质基础。研究目的本实验研究在前期研究基础上,基于药理活性导向法,从白术根茎中筛选、分离出具有调节IEC-6细胞迁移的白术多糖组分,并对其分子结构进行鉴定和表征。研究方法1.先采用超声水提醇沉获得白术粗多糖,然后基于药理活性导向法,结合利用DEAE纤维素柱和Sephadex LH-20葡聚糖凝胶等色谱柱层析分离纯化粗多糖,得到生物活性白术多糖组分。2.综合利用完全酸水解,高效液相色谱法(HPLC),凝胶渗透色谱-多角度激光散射联用技术(GPC-MALLS),红外光谱扫描分析(FT-IR),环境扫描电镜(ESEM),1D-和2D-NMR等化学物理手段和波谱数据分析鉴定和表征活性多糖组分的分子结构。3.采用手术刀片划痕法建立大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)迁移模型,评价白术多糖组分对IEC-6细胞迁移的影响。4.采用细胞动态分析仪(RTCA)建立IEC-6细胞增殖模型,评价白术多糖组分对IEC-6细胞增殖的影响。研究结果1.本研究通过DEAE纤维素柱和Sephadex LH-20凝胶柱等分离纯化,从白术根茎中筛选分离出新的白术活性多糖组分YY13008和YY21714。2.通过完全酸水解,高效液相色谱法(HPLC),凝胶渗透色谱-多角度激光散射联用技术(GPC-MALLS),红外光谱扫描分析(FT-IR),环境扫描电镜(ESEM),1D-和2D-NMR等化学物理手段和波谱数据分析,结果证明白术多糖组分YY13008和YY21714均为线团型均一性多糖,其分子量分别为6546和2898,分子结构是由大量果糖单元以β(2→1)果糖苷键,终末端以α(1→2)葡萄糖苷键连接构成的果聚糖,其果糖单元和葡萄糖单元的摩尔分子比例分别为39:1和17:1。3.IEC-6细胞迁移活性测试结果显示,白术多糖组分YY13008和YY21714均能够使α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO)负荷下的细胞迁移恢复至接近正常水平,但在无DFMO负荷时,多糖组分YY13008和YY21714均对IEC-6细胞迁移没有明显影响。4.通过细胞动态分析仪观察白术多糖组分YY13008和YY21714对IEC-6细胞增殖的影响,结果表明YY13008和YY21714均能一定程度上促进IEC-6细胞增殖,与阳性对照EGF作用相似。研究结论本研究基于药理活性导向法,从白术根茎部位筛选分离出新的多糖组分YY13008和YY21714,两者均是线团型均一性多糖,其分子结构是由大量果糖单元以β(2→1)果糖苷键,终末端以α(1→2)葡萄糖苷键连接构成的果聚糖;白术多糖组分YY13008和YY21714均能一定程度上促进IEC-6细胞增殖,并均可使由DFMO所致的IEC-6细胞迁移抑制恢复至正常水平,而多糖组分在无DFMO时则对IEC-6细胞迁移无明显影响。这些研究发现不同于已发表研究结果。本论文为探讨白术多糖调节细胞迁移的药效物质基础提供了实验依据。