基于膜片钳技术的洋葱盐胁迫及缓解效应研究

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土壤盐渍化是当今世界农业所面临的主要危机之一。Na+作为盐渍土壤中主要的阳离子,几乎能影响到植物的所有重要生命过程,严重限制了植物生长和作物产量。如何更深入地研究盐胁迫缓解效应、开发相应的施肥机械装置成为现代农业发展急需解决的问题。本文针对不同程度钠盐胁迫,应用膜片钳法和电生理测试系统,使尖端只有1μm左右的微电极与原生质膜形成高阻封接(几GΩ到几十个GΩ),研究胞外不同浓度的Ca2+对Na+通透质膜形成的离子电流的影响,以抑制率为桥梁,建立了Na—Ca浓度关系模型,为宏观意义上的精确施用钙肥提供了一定的参考。利用此模型和文丘里原理设计了一种施肥装置,为含钙改良剂的调配及喷施提供了硬件设施。本文的研究工作主要包括以下几个方面:(1)洋葱内表皮细胞的细胞壁是微电极尖端与细胞膜实现高阻封接的一大障碍,本文选用“一步酶解法”,通过改进本实验室现有关于纯化原生质体酶解混合液离心转速和时间的组合,获得了产量更大、活性更好的原生质体,使高阻封接更容易实现。(2)K+和Ca2+选择性通道对于大量Na+流入胞质的贡献很少这一观点已在拟南芥、黑麦等植物上获得证实。本文选择洋葱内表皮原生质体作为材料,通过应用K+通道的抑制剂TEA+和Ca2+通道的抑制剂verapamil研究Na+电流的变化规律得知,对于洋葱内表皮细胞来说,K+和Ca2+选择性通道并非大量Na+透入原生质膜的主要途径,即贡献很少。(3)本文应用膜片钳技术从微观角度研究了单一细胞抗钠盐过程。胞外含不同浓度的Na+情况下,通过微电极尖端与细胞膜紧密接触形成高阻封接,记录下Na+电流曲线并通过Clampex软件测量了电流大小。结果发现,Na+流经离子通道形成的电流具有浓度依赖性:当胞外Na+浓度从25 mmol/L增大到50mmol/L时,电流幅度随之增长,但增长较慢(14.1%);75 mmol/L的胞外Na+浓度相对50mmol/L时的电流幅值增长了36.1%;而100mmol/L相对75mmol/L来说,电流则增加了43.2%。由此可见,一方面随着胞外Na+浓度的递增,Na+电流也逐渐增大;另外,高浓度钠盐环境比低浓度的钠盐环境下的流入胞质形成的Na+电流增长速度快。(4)通过测量胞外不同Na+和Ca2+浓度组合且同一刺激电压下的电流值,计算Ca2+对Na+电流的抑制率,并以此为桥梁(抑制率大于60%),建立了Na—Ca浓度关系模型:给出了求解有效缓解不同Na+浓度盐胁迫所需的Ca2+浓度值的方法,包括Ca2+浓度最大值[Ca2+]max、最小值[Ca2+]min和最优值[Ca2+]optimal分别与Na+浓度关系曲线图以及曲线对应的拟合求解方程。模型的建立给实际应用中向盐渍土壤溶液中施加含钙改良剂缓解盐分胁迫的事实以及精确施肥提供了一定理论依据和数据参考,并对从离子通道水平研究农作物的抗胁迫机制方面有着重要的理论价值。(5)本文利用Na—Ca浓度关系模型,首先计算出缓解盐胁迫所需的Ca2+浓度,然后参照已有结构,设计了一个并联式文丘里施肥装置,确定了文丘里管结构参数。当肥液浓度为6.72%时,通过调节阀控制文丘里管两端压差就可以使喉部压力在-0.7~-0.2bar之内,实现稳定吸肥,对应能缓解的钠盐胁迫范围为52.5~88.2 mmol/L。当钠盐胁迫浓度在25~52.5 mmol/L和88.2~100 mmol/L两个范围时,可固定肥水池中浓度分别为4.50%和8.50%,从而实现稳定吸肥。钙缓解剂和灌溉水通过该混肥装置获得确定浓度后一同喷施到作物叶面上,然后直接进入植物体抑制钠盐侵入,为通过叶面喷施钙肥缓解盐胁迫提供了硬件保障。
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