牙齿的发育过程是依赖于预定牙齿发生部位的上皮组织与其下方的间充质之间的相互诱导而发生的。因此,牙齿的生物性再生至少需要两种细胞:釉质形成所需的牙源性上皮细胞和形成牙髓牙本质复合体的牙源性间充质细胞。到目前为止,有关牙源性间充质细胞的替代研究较多,例如成体的牙髓干细胞、骨髓基质细胞、皮肤的真皮细胞以及毛囊细胞等均被证明具有向牙源性间充质细胞转化的能力。然而,在寻找合适的细胞向牙源性上皮细胞替代方面成功的研究较少。尽管有学者认为成体骨髓来源的细胞可以向成釉细胞转化,但是它可以同时向成釉细胞样细胞和牙源性间充质细胞这两种细胞转化的能力限制了它的应用。有研究在组织工程牙齿的构建中口腔腭粘膜上皮可以替代牙源性上皮,但是此研究必须建立在使用胚胎期或出生1天的自体口腔腭粘膜上皮的基础上,因此也限制了它的应用。这种局限性促使我们寻找一种新的细胞能够向牙源性上皮方向分化。胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的能力,近年来受到许多学者广泛关注。有研究证实胚胎干细胞可以分化为皮肤表皮细胞,肺上皮细胞以及胸腺上皮细胞等,但是胚胎干细胞是否可以向牙源性上皮方向转化还尚未见报道。因此对于这一问题的回答,无疑于对解决牙齿再生研究中上皮源性种子细胞来源的瓶颈问题具有重要意义。本课题主要进行了以下几方面的研究:1.胚胎干细胞的培养及鉴定目的:培养胚胎干细胞R1系及CGR8系并对其进行鉴定。方法:胚胎干细胞极易受外界因素的影响,对生长条件要求非常苛刻。常规的胚胎干细胞培养液中含有高糖MEM培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和非必需氨基酸等,为了防止胚胎干细胞发生分化,还要在培养液中加入白血病抑制因子(LIF),胎牛血清的质量及浓度也是影响ES细胞生长状况的重要因素,为此本实验采用GIBCO公司生产的胎牛血清,所加浓度为15%。形成的ES细胞样集落,继续培养后观察集落的生长状态,并通过碱性磷酸酶染色,在体外形成拟胚体,移植入裸鼠皮下4周后取材,组织学观察进行鉴定。结果:ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,在AKP底物作用下,未分化的ES细胞显微镜下为棕褐色,分化的不着色。悬滴法培养ES细胞两天后生成拟胚体,它是胚胎干细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体结构,早期发育的简单拟胚体包含了外层的原始内胚层和内层的原始外胚层,这种结构与胚胎发育过程中的卵圆柱期结构十分相似。体内研究表明,将小鼠胚胎干细胞注入裸鼠皮下4周后,可形成含有三胚层组织的畸胎瘤。结论:胚胎干细胞具有高度的复制能力及多向分化的潜能。2.成釉细胞条件培养液诱导小鼠ES细胞分化的研究目的:探讨成釉细胞构建的微环境对于小鼠胚胎干细胞的诱导能力。方法:本实验胚胎干细胞采用两种途径分化:生成拟胚体(EB)与不生成拟胚体直接诱导分化的途径,利用发育早期成釉细胞分泌的信号分子在体外模拟成牙微环境,观察对小鼠胚胎干细胞增殖分化的影响。我们用成釉细胞的条件培养液诱导胚胎干细胞,并选择两个时间点,7天和14天,从形态学观察分化后细胞的形态特征,并从基因水平和蛋白水平检测诱导后细胞的表型变化。随后我们将两个诱导组的细胞植入裸鼠皮下4周观察体内结果,并将出生1天的C57小鼠的成釉器同样植入裸鼠皮下作为阳性对照。结果:体外利用成釉细胞无血清条件培养液诱导小鼠胚胎干细胞,形态学观察诱导后可促进其增殖和分化,诱导后的部分细胞形态与成釉细胞形态相似。随后的基因或蛋白检测发现诱导后的细胞具有牙源性上皮细胞的表型。其中经过EB诱导分化途径比直接诱导分化途径的效率要高一些。RT-PCR结果表明诱导后的胚胎干细胞表达牙上皮相关蛋白CK14、AMBN及AMGN,免疫荧光结果及Western Blot结果与RT-PCR结果一致。体内实验更验证了体外的结果,将诱导后的小鼠胚胎干细胞经纤维蛋白胶包裹移植于裸鼠皮下,培养4周后观察经过EB诱导分化途径的细胞在体内可形成一些上皮样角化组织,进一步免疫组织化学染色显示角化组织可表达CK14、AMBN、AMGN,具有类似成釉器样组织植入裸鼠皮下生成组织的特性。然而不经过EB诱导分化途径的细胞在体内生成了大量的结缔组织,未见典型的上皮样组织结构。当通过拟胚体途径经ASF-CM条件培养液诱导14天的胚胎干细胞与小鼠牙胚细胞混合植入裸鼠皮下后,结果显示,诱导后的胚胎干细胞在牙胚细胞的诱导下,参与了矿化组织的形成,因为经CFSE标记带绿色荧光的胚胎干细胞与矿化组织部分重合。未诱导的胚胎干细胞与牙胚细胞混合后,体内结果显示移植物仍然生成畸胎瘤。结论:以上结果提示,成釉细胞无血清条件培养液所提供的成牙微环境可在体外和体内促进小鼠胚胎干细胞的牙向分化,通过拟胚体途径的分化效率更高一些,且通过拟胚体途径诱导后的胚胎干细胞在体内能够生成牙源性上皮样组织,提示我们胚胎干细胞向牙源性上皮方向转化的可能性。3.牙胚细胞条件培养液诱导小鼠ES细胞分化的研究目的:探讨牙胚细胞构建的微环境对于小鼠胚胎干细胞的诱导能力。方法:本实验胚胎干细胞采用两种途径分化:生成拟胚体(EB)与不生成拟胚体直接诱导分化的途径,利用发育早期牙胚细胞分泌的信号分子在体外模拟成牙微环境,观察对小鼠胚胎干细胞增殖分化的影响。本实验主要从形态学、基因及蛋白水平进行检测,并将诱导后的细胞移植入体内进行观察。结果:体外利用牙胚细胞条件培养液诱导培养小鼠胚胎干细胞,通过两种分化途径,并未实现向牙源性上皮细胞方向的表型转化。形态学观察经过牙胚条件培养液诱导后,两种途径诱导的细胞增殖能力缓慢,且诱导14天后细胞出现凋亡。基因表达仅表达DMP1和CK14,未表达牙齿上皮样相关基因。体内移植物为疏松的结缔组织,少量移植物体内生成畸胎瘤。未见成釉细胞及牙齿相关组织形成。结论:以上结果提示,与成釉细胞条件培养液相比,牙胚细胞条件培养液所提供的成牙微环境并不能促进小鼠胚胎干细胞的牙向分化。