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产后子宫感染是奶牛常见的生殖疾病,导致子宫蓄脓、子宫炎或子宫内膜炎等,造成母牛淘汰率升高,对养殖业造成巨大经济损失。正常情况下母牛产后子宫在多种因素的调控下进行再生修复,以恢复正常的组织结构和生理功能。但产后子宫感染可延迟奶牛子宫内膜的恢复,导致子宫复旧延迟。大肠杆菌(Escherichia coli,E.Coli)是导致子宫感染的主要病原体之一,主要通过内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)发挥致病作用。孕酮作为重要的性激素,在奶牛发情与妊娠周期中发生动态变化,与雌激素共同调节子宫内膜的增殖与分化。孕酮水平升高可增加奶牛子宫感染风险。尽管有研究发现孕酮参与调节细胞增殖,但孕酮对子宫内膜细胞的影响报道较少。山羊与奶牛的生殖机制相似,经历类似的子宫修复过程。为揭示孕酮对子宫内膜修复的影响机制,本试验以山羊子宫内膜基质细胞(goat endometrial stromal cells,gESC)为研究对象,探索在LPS作用下孕酮对内膜基质细胞活力、细胞周期、细胞增殖相关因子和信号通路的影响。试验分为四组,空白对照组,细胞不做任何处理;LPS处理组,以1μg/mLLPS处理细胞;孕酮处理组,分别以1、3、5 ng/mL浓度的孕酮单独处理细胞;孕酮与LPS共处理组,分别以1、3、5ng/mL浓度的孕酮与1 μg/mLLPS共处理细胞。试验结果如下:(1)孕酮对gESC细胞增殖与细胞周期的影响:用上述方法处理细胞24 h,通过CCK-8和流式细胞术分别测量细胞活力和细胞周期。结果显示:不同浓度孕酮处理组或LPS组,其细胞增殖活力均上调(p<0.01);与LPS组相比,不同浓度孕酮与LPS共处理组的细胞增殖均下降p<0.01)。不同浓度孕酮处理gESC,其S期细胞数目均上升(p<0.01),细胞增殖指数(PI)均升高(p<0.01),其中3 ng/mL或5 ng/mL孕酮处理增加了 G0/G1期的细胞数量(p<0.05);LPS组细胞的G0/G1期下调,S期的细胞数量增加(p<0.01),细胞PI上调(p<0.01)。与LPS组相比,采用不同浓度孕酮与LPS共处理gESC,其G0/G1期的细胞数量均升高(p<0.01),S期细胞数量减少(p<0.01),PI下调(p<0.01)。因此,单纯孕酮处理或LPS处理均可促进子宫内膜基质细胞的细胞周期向S期发展,使细胞整体增殖水平升高;孕酮可抑制LPS诱导的细胞增殖和细胞周期发展,使细胞阻滞于G0/G1期。(2)孕酮对gESC修复相关基因表达的影响:采用上述方法处理细胞,于3、12和18 h后检测PR、VEGF、EGFR、Cx-43和b-FGF的mRNA表达量。结果显示:不同浓度孕酮处理组上述各增殖因子的mRNA表达量均升高,处理3 h其mRNA表达量较其它时间点增加明显(p<0.01)。LPS组,除18h时EGFR mRNA表达量无显著变化外(p>0.05),在其它时间点的其它增殖因子的mRNA表达量均升高(p<0.05)。与LPS组相比,孕酮与LPS共处理组在3h时PR、VEGF、EGFR和b-FGF的mRNA表达均降低(p<0.05);在12h 时 EGFR、Cx-43 和 b-FGF mRNA 表达量均下降(p<0.01);在 18h 时,PR、VEGF和Cx-43 mRNA表达均下降(p<0.01)。因此,单纯孕酮处理或LPS处理可上调PR、VEGF、EGFR、Cx-43 和 b-FGF 的 mRNA 表达;孕酮可抑制 LPS 诱导的 PR、VEGF、EGFR、Cx-43和b-FGF的mRNA表达。(3)孕酮对gESC增殖相关信号通路的影响:采用上述方法处理细胞30 min,采用Westernblot检测β-catenin、c-Myc和cyclin-D1的蛋白表达,以及PI3K/Akt通路的磷酸化水平;通过免疫荧光检测β-catenin入核情况。结果显示:在单纯孕酮处理组,β-catenin和cyclin-D1的蛋白表达显著升高(p<0.05);11ng/mL或3 ng/mL孕酮处理组c-Myc蛋白表达上调(p<0.05);3ng/mL或5ng/mL孕酮处理组的Akt磷酸化水平升高(p<0.05);不同浓度孕酮处理组的PI3K磷酸化水平显著上升(p<0.01)。LPS组的β-catenin、c-Myc和cyclin-D1表达量升高(p<0.05),β-catenin入核增多;Akt和PI3K磷酸化水平升高(p<0.05)。与LPS组相比,不同浓度孕酮与LPS共处理组的β-catenin蛋白表达均下降(p<0.01),β-catenin入核减少;5 ng/mL孕酮与LPS共处理组的cyclin-D1表达量下降(p<0.01);1 ng/mL或3ng/mL孕酮与LPS共处理后,c-Myc表达量下降(p<0.05)。孕酮与LPS共处理组的Akt和PI3K磷酸化水平均下降(p<0.05)。由此可见,单纯孕酮处理或LPS处理可激活Wnt/β-catenin 和 PI3K/Akt 通路;孕酮可抑制 LPS 激活的 Wnt/β-catenin 和 PI3K/Akt 通路。综上所述,孕酮或LPS单独处理gESC,可促进细胞增殖和细胞周期进程,促进细胞各种修复相关因子的表达和增殖相关通路的激活。孕酮与LPS共处理细胞,可抑制LPS诱导的细胞增殖和细胞周期进程以及Wnt/β-catenin和PI3K/Akt通路的活化,下调PR、VEGF、EGFR、Cx-43和b-FGF的mRNA表达。因此,孕酮可抑制LPS诱导的细胞增殖效应,该效应可能通过Wnt/β-catenin和PI3K/Akt通路介导。