研究背景RFC-1与ABCB1是MTX出入细胞的关键转运蛋白,很多研究者发现RFC-1G-80-A和ABCB-1 C 3435 T的基因多态性与MTX的疗效和不良反应相关,MTX-PGs是MTX发挥药效的主要活性成分。但是RFC-1 G-80-A和ABCB1 C 3435 T基因的多态性和MTX-PGs浓度关系未见报道,我们推测RFC-1 G-80-A和ABCB-1 C 3435 T可能通过影响MTX-PGs从而影响MTX的疗效的不良反应。因此我们采用实时荧光定量PCR检测重庆地区服用MTX治疗的类风湿关节炎患者RFC-1 G-80-A及ABCB1 C3435 T多态性,研究其与RA患者红细胞MTX-PGs浓度相关性,来探讨RFC-1 G-80-A和ABCB-1 C 3435 T基因多态性影响甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的疗效和不良反应发生的机制。目的:建立酶联免疫吸附测定法检测红细胞中MTX-PGs浓度的方法,并研究RFC-1 G-80-A和ABCB-1 C 3435 T基因多态性与红细胞内MTX-PGs浓度的相关性。来探讨RFC-1 G-80-A和ABCB-1 C 3435 T基因多态性影响甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的疗效和不良反应发生的机制,为类风湿关节炎个体化治疗提供理论依据。方法:1、收集2012年10月~2014年10月第三军医大学西南医院风湿免疫科门诊及住院中服用甲氨蝶呤的类风湿关节炎患者,按入选、排除标准筛选后入组,登记他们的人口学资料及MTX服用剂量,并采集患者患者服用甲氨蝶呤72小时后的静脉血4ml。共收集患者95例,其中男18例,女77例。2、采用酶联免疫吸附法测定测定类风湿关节炎患者的红细胞中MTX-PGs浓度,用苯酚氯仿法提取RA患者全血基因DNA,选用FQ-PCR方法对RA患者RFC-1 G-80-A和ABCB-1 C 3435 T 2个SNP位点进行基因分型。3、采用多元线性回归分析体重、剂量、体重指数、体表面积、单位体重口服剂量、单位体表面积口服剂量及年龄对红细胞中MTX-PGs浓度的影响,采用单因素方差检验分析基因SNPs与药物浓度的相关性。结果:1.建立了测定红细胞内MTX-PGs浓度的酶联免疫吸附检测方法。MTX-PGs不受血浆中叶酸的干扰,在0.1ng/ml~10ng/ml之间有良好的线性关系(R2=0.9962),双对数回归方程为y=-0.4772X-0.1472(R2=0.9902),检测灵敏度及,检测下限分别为0.087ng/mL、0.2ng/mL。在这个实验中,回收率为94.2%~112.8%,平均回收率:103%。RSD范围为:7.2%~17.7%,平均RSD:RSD 13.5%。精密度实验:批内RSD为:3.3%~8.7%,平均批内RSD为:6.5%。批间RSD为:7.6%~9.9%,平均批间RSD为:8.3%。2、95例RA患者的红细胞内MTX-PGs浓度范围为:59.9~149ng/ml,平均浓度为88.09±19.29ng/ml。年龄、性别、体重、体重指数和体表面积对MTX-PGs浓度无显著影响,单位体重剂量和剂量与MTX-PGs浓度呈正相关(P=0.000,P=0.049)3、95例服用甲氨蝶呤的类风湿关节炎患者,RFC-1 G-80-A的基因型分布:(GG/AG/AA)为(32.5%/47.4%/20.0%),ABCB-1 C 3435 T基因型(TT/CT/CC)分布频率:(18.9%/46.3%/34.7%),基因型分布均符合H-W平衡(χ2=1.309,P=0.595;χ2=0.654,P=0.721),样本均具有群体代表性。4、RFC-1 G-80-A和ABCB1 C 3435 T不同基因型之间的MTX-PGs浓度无统计学差异,所有P值均大于0.05,说明在本研究中这RFC-1 G-80-A和ABCB1 C 3435 T这两个位点的基因多态性不影响红细胞内MTX-PGs浓度。结论:1、本研究建立的ELSIA测定MTX-PGs方法简单、准确、应用性强,满足临床血药浓度监测的需要。2、重庆地区RA患者RFC-1 G-80-A基因的分布特点(GG/AG/AA):(32.5%/47.4%/20.0%),与汉族人群分布无统计学差异3、重庆地区RA患者ABCB1 C 3435 T基因的分布特点(TT/CT/CC):(18.9%/46.3%/34.7%)与汉族人群分布无统计学差异。4、RA患者红细胞内MTX-PGs浓度范围为59.9~149ng/ml,平均浓度为88.09±19.29ng/ml5、RA患者红细胞内MTX-PGs浓度与年龄、性别、身高、体重指数不相关。6、RA患者红细胞内MTX-PGs浓度与MTX使用剂量、单位体重剂量呈正相关。7、重庆地区RA患者RFC-1 G-80-A基因和ABCB1 C 3435 T基因多态性与红细胞内MTX-PGs浓度不相关