论文部分内容阅读
本实验构建针对大鼠的Ⅱ类主要组织相容性复合物反式转录激活因子(classⅡ major histocompability complex transactivator,CⅡTA)和髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因的短发夹状 RNA(small hairpin RNA,shRNA)质粒和纳米阳离子高分子脂质体;应用两者偶合形成纳米载体于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞(dendritic cell,DC),观察其介导RNA干扰对CⅡTA和MHC-Ⅱ以及MyD88基因表达的抑制,并筛选相对高效的载shRNA纳米载体;评价其介导RNA干扰目的基因沉默干预免疫识别的效果;研究纳米载体介导RNA干扰CⅡTA和MyD88干预免疫识别在控制移植免疫排斥反应中的作用和探讨其机制。一、纳米载体的构建及体外转染实验目的:构建载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体并偶合为纳米载体,观察其体外转染HCT-116细胞的转染效率,确定实验转染方案。方法:构建针对大鼠CⅡTA和MyD88基因载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体;对纳米阳离子高分子脂质体进行表征;应用体外培养HCT-116细胞,经MTT法验证纳米阳离子高分子脂质体的生物安全性;通过载shRNA质粒与纳米阳离子高分子脂质体偶合实验,确定两者最佳结合比;应用载shRNA质粒与纳米阳离子高分子脂质体偶合形成纳米载体,分别设置空白对照组、Lipofectamine组、单纯质粒组和以不同质量比载shRNA质粒与纳米阳离子高分子脂质体偶合形成的纳米载体组(两者质量比分别为1:0.5,1:1,1:2,1:3和1:4),于体外转染HCT-116细胞,采用倒置荧光显微镜观察和流式细胞术(FCM)观察转染效果,比较转染效率。结果:载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体构建成功;纳米阳离子高分子脂质体理化性能稳定、安全低毒(IC50=7.605×10-2g/L)且免疫原性低,跨膜能力强,可用于构建载shRNA纳米载体;载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体偶合形成纳米载体的最佳结合质量比为1:2;在载shRNA质粒和纳米阳离子高分子脂质体以最佳结合比偶合形成纳米载体时,其转染HCT-116细胞的转染效率最高(28.19±5.38%),且优于转染剂Lipofectamine组(P<0.01)。结论:纳米阳离子高分子脂质体制备简便、安全低毒,免疫原性低;其与载shRNA质粒于最佳结合比偶合成功构建纳米载体转染HCT-116细胞,具有高效和稳定的转染效率,可用于介导RNA干扰抑制免疫识别相关基因CⅡTA和MyD88表达的研究。二、纳米载体介导沉默免疫识别相关基因表达的研究目的:观察纳米载体介导RNA干扰对免疫识别相关基因CⅡTA和MyD88表达的抑制效果以及CⅡTA基因对于MHC-Ⅱ基因表达的调控作用。方法:体外培养大鼠骨髓源DC;应用针对大鼠CⅡTA和MyD88基因的各三个纳米载体,分别设置空白对照组、单纯纳米组、pHK-纳米载体阴性对照组和三个pCⅡTA-纳米载体干预组或三个pMyD88-纳米载体干预组,分别转染DC,以荧光实时定量 PCR、FCM 和 Western blot 检测 DC 转染后 CⅡTA 和 MHC-Ⅱ 及 MyD88 的表达变化。结果:大鼠骨髓源DC培养成功;与空白对照组、单纯纳米组、pHK-纳米载体阴性对照组相比,三个pC Ⅱ TA-纳米载体干预组DC转染后CⅡ TA和MHC-Ⅱ mRNA转录水平及MHC-Ⅱ蛋白表达水平均显著性减低(P<0.01),CⅡTA与MHC-Ⅱ基因表达呈高度正相关;pC ⅡTA 2-纳米载体干预组对CⅡTA与MHC-Ⅱ基因表达的抑制更为明显,CⅡTA mRNA转录水平为0.12±0.04,MHC-Ⅱ mRNA 转录水平为 0.10±0.04,MHC-Ⅱ 蛋白表达水平为 22.08±3.07%;三个pMyD88-纳米载体干预组DC转染后MyD88 mRNA转录水平及MyD88蛋白表达水平均显著性减低(P<0.01),MyD88的mRNA转录水平及蛋白表达水平呈高度正相关;pMyD88 1-纳米载体干预组对目的基因表达抑制更为明显,MyD88的mRNA转录水平为0.11±0.04,MyD88蛋白表达水平为0.11±0.05。结论:应用成功构建pC ⅡTA-纳米载体转染大鼠骨髓源DC,可显著抑制DC的CⅡTA和MHC-Ⅱ基因表达;CⅡTA与MHC-Ⅱ的基因表达具有高度正相关,提示CⅡTA严格调控MHC-Ⅱ表达,纳米载体介导RNA干扰CⅡTA可明显抑制MHC-Ⅱ基因表达;应用成功构建pMyD88-纳米载体转染大鼠骨髓源DC,可显著抑制DC的MyD88基因表达;pCⅡTA 2-纳米载体和pMyD88 1-纳米载体介导RNA干扰相对高效,两者可进一步应用于评价纳米载体介导干预免疫识别的实验研究。三、纳米载体介导干预免疫识别作用的研究目的:评价PCⅡTA 2-纳米载体和pMyD88 1-纳米载体介导RNA干扰干预免疫识别的效应,探讨免疫识别相关基因沉默影响免疫识别的作用机制。方法:分别应用pCⅡTA 2-纳米载体和pMyD88 1-纳米载体转染大鼠DC;设置阳性对照组、单纯纳米组、阴性HK纳米载体组、CⅡTA或MyD88沉默干预组和阴性对照组;与异系大鼠脾淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养,分别经MTT法和流式细胞术观察CⅡTA沉默干预DC对淋巴细胞增殖状态及T细胞表型的影响,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)的含量。通过脂多糖刺激实验,应用荧光实时定量PCR和Western Blot检测LPS刺激后MyD88沉默干预DC MyD88表达水平,分别采用ELISA及FCM,检测LPS刺激后MyD88沉默干预DCIL-2和IFN-y分泌水平,以及MHC-Ⅱ蛋白抗原表达。结果:混合淋巴细胞培养后,与阳性对照组、单纯纳米组和阴性HK纳米载体组比较,CⅡTA沉默干预组淋巴细胞增殖刺激指数明显降低(1.15±0.14,P<0.01),上清液中细胞因子INF-y和IL-2含量显著减少(INF-γ42.39±7.68 pg/mL,IL-2 67.83±18.35pg/mL;P<0.01),CD4 阳性细胞百分比减低(48.38±8.63%,P<0.01)和 CD4+/CD8+比值下降(1.89±0.26,P<0.01),而 CD8 阳性细胞百分比的差异未见显著性(P>0.05);经脂多糖刺激后,与阳性对照组、单纯纳米组和阴性HK纳米载体组比较,MyD88沉默干预组DC的MyD88 m RNA转录水平和蛋白表达明显降低(0.22±0.08,0.16±0.04;P<0.01),其分泌细胞因子 INF-y 和 IL-2 分泌水平显著下降(32.49±5.65pg/mL,21.08±4.13pg/mL;P<0.01),MHC-Ⅱ蛋白抗原的表达也明显减少(45.21±5.09%,P<0.01)。结论:纳米载体介导CⅡTA和MyD88基因沉默有效地抑制了免疫识别过程,减轻了免疫应答。其机制为免疫原性降低及免疫识别信号转导通路阻断,抑制了 T细胞增殖与活化及抗原呈递细胞自身的分化成熟,导致针对外来抗原刺激的免疫识别显著减低,从而有效减轻免疫反应强度,有利于更好地抑制移植排斥反应。