论文部分内容阅读
背景:MAPK/MAK/MRK Overlapping Kinase（MOK）属于MAP激酶超家族,是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,广泛存在于哺乳动物细胞内。该类激酶参与不同信号的转导,为多种细胞免疫及不同受体介导的信号途径所共享。Caspase-3作为凋亡的最终执行者,在caspase介导的凋亡信号通路中占有重要地位。Caspases信号通路中,通常caspases-1,4,5,11,12,13,14被称为炎性caspases,参与促炎因子的成熟;caspases-2,8,9,10位于级联反应的上游,能启动下游的caspases蛋白激酶;caspases-3,6,7则位于级联反应的下游,在剪切蛋白方面起重要作用,促使细胞发生凋亡。Caspase-3是caspase的主要效应因子,具有细胞凋亡关键执行者的身份。在响应一个凋亡信号时,失活的caspase-3被激活从而引发细胞凋亡。因此,caspase-3成为检测细胞凋亡的重要指标之一。本文研究了MAP激酶超家族新成员MOK介导caspase信号通路对细胞凋亡的调控,MOK可能通过caspase信号通路间接影响细胞凋亡。该研究为探索MOK的作用机制和贝类免疫凋亡提供了基础信息。方法:采用RACE PCR技术克隆出了褶纹冠蚌MOK和caspase-3的c DNA序列（命名为CpMOK和Cpcaspas-3）,通过荧光定量PCR手段检测MOK和caspase-3基因在褶文冠蚌的肝胰腺、肾、鳃、外套膜、闭壳肌、血细胞和心脏7种组织中的表达情况;以及脂多糖（LPS）,肽聚糖（PGN）,聚肌胞苷酸（Poly I:C）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）刺激后,CpMOK和CpCaspase-3基因在肝胰腺,鳃和肾中的表达变化;通过建立创伤修复模型,检测CpMOK激酶在创伤修复期间各时间段的表达情况;对褶纹冠蚌进行CpMOK的RNA干扰,通过q PCR、ELISA、Wester Blot和Tunel观察其对caspase信号通路级联反应的影响及细胞凋亡情况。利用原核表达技术对CpMOK和CpCaspase-3基因进行表达,获得CpMOK和CpCaspase-3的重组蛋白,分析蛋白的体外结合情况。亚细胞定位,分析重组CpMOK的核质定位。结果:1.CpMOK的基因全长2290 bp,5’端为92 bp;3’端为853 bp;开放阅读框的长度为1413 bp,由470个氨基酸组成。包含一个S＿TKC结构域（23-304 aa）。经Expasy分析,CpMOK蛋白的理论分子量为54.31 k Da,等电点为9.51。克隆得到的CpCaspase-3全长为2425 bp,开放阅读框为969 bp,编码322个氨基酸。CpCaspase-3包含一个CASc结构域,推导的蛋白分子量为36.44 k Da,等电点为5.78。2.CpMOK和CpCaspase-3的m RNA在蚌的肝胰腺、鳃、肾、外套膜、闭壳肌、心脏和血细胞组织中均有表达。其中,CpMOK在肝胰腺中的表达量最高,血细胞中最少。CpCaspase-3在肝胰腺中表达量最高,其次是外套膜。经LPS,PGN,Poly I:C以及嗜水气单胞菌刺激后,CpMOK和CpCaspase-3的m RNA表达出现明显的变化,呈现先升高后降低的趋势。构建了褶纹冠蚌的创伤模型,褶纹冠蚌的外套膜受创后,CpMOK表达上调,1 d时表达量达到最高,15 d时已逐渐恢复。这些表明CpMOK参与了褶纹冠蚌的免疫反应。3.构建CpMOK的双链RNA（ds RNA）进行干扰试验,结果发现凋亡基因信号caspase-1,caspase-3,caspase-7,caspase-8以及caspase-9的m RNA表达上调。同时利用ELISA法检测发现caspase-1,-3,-7,-9以及细胞色素C（cytc）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的蛋白在一定程度上均上调。利用Tunnel法检测凋亡细胞情况,发现干扰后凋亡细胞的数目增多。这些结果暗示CpMOK的敲低可能会引起褶文冠蚌caspase介导的细胞凋亡。4.Western-blot实验结果表明,AH+ds GFP,AH+ds MOK,AH组较空白对照（blank）组相比MOK激酶的磷酸化水平明显减少,尤其是AH+ds MOK组。这些结果表明:CpMOK的敲低可能通过影响激酶的磷酸化水平介导caspase信号通路的调节。构建p GEX 4T-1-CpMOK、p ET28a（+）-CpCaspase-3表达质粒,诱导蛋白表达,纯化GST-CpMOK和HIS-CpCaspase-3蛋白,其浓度分别为0.776 mg/m L and 0.453 mg/m L。CpMOK和CpCaspase-3蛋白体外结合呈现假阳性。5.细胞定位实验表明CpMOK主要分布在细胞核,少量分布在细胞质。