大黄鱼嗅觉受体基因及功能的研究

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脊椎动物之所以能识别自然界中成千上万种气味,主要归因于其嗅觉系统。目前科学家已经对动物嗅觉系统展开了详细的研究,主要包括以下几个方面:动物的嗅觉器官的形态、解剖学结构和细胞形态的研究;动物嗅觉受体基因及其进化的关系;嗅觉神经系统与信号转导;嗅觉受体与它的配体之间的关系等几个领域,从哺乳动物到鱼类展开了了一系列的研究。大黄鱼是我国重要的经济鱼类之一,本研究课题针对大黄鱼的嗅觉器官结构和神经细胞的形态、嗅觉受体基因及其进化、嗅觉受体和气味之间的关系等领域做了详细的研究,为进一步的了解大黄鱼的摄食生理学提供一定的理论基础。   (1)大黄鱼的嗅觉器官的解剖学结构的研究。大黄鱼的嗅觉器官由花朵状的嗅囊,与通向大脑一条比较粗的嗅觉神经通路组成;利用扫描电镜对大黄鱼的嗅觉器官进行观察,结果显示大黄鱼的嗅囊由30个排列整齐的嗅板组成,嗅板上分布着无数的纤毛与微绒毛,而这些纤毛与微绒毛是嗅觉神经元的树突,这些纤毛与微绒毛分布着嗅觉受体;利用三类小鼠Gα蛋白抗体与大黄鱼的嗅觉上皮组织做免疫组化的研究,结果表明大黄鱼的三类嗅觉神经元与3种Gα蛋白相联系,其中Gαolf分布在纤毛细胞上,Gαo分布于微绒毛细胞上,Gαq分布在隐窝状细胞上。   (2)嗅觉受体基因的获得。根据斑马鱼与红鳍东方鲀的嗅觉受体(OR)基因序列的保守区域设计的引物,利用过RT-PCR和RACE的技术,从大黄鱼的嗅觉上皮细胞中,获得89个全长cDNA和22个部分cDNA,同时也说明了有~100个嗅觉基因在嗅觉上皮细胞中表达;利用Southern blot的方法,对大黄鱼两个基因做了研究,验证了大黄鱼的OR基因在基因组中呈多拷贝分布。   (3)大黄鱼嗅觉受体基因与其他鱼类的进化关系。首先,利用不同物种的线粒体基因组中12个蛋白构建了系统发生树,从而确立12个物种之间的进化关系;再次,利用获得的111大黄鱼的OR基因与其他11种鱼类和1种两栖动物的OR基因构建了贝叶斯系统发生树。发现的鱼类的OR基因的进化与它们的进化历史相关。大黄鱼的嗅觉基因与三刺鱼,红鳍东方鲀和黑青斑河鲀的嗅觉基因进化关系比金鳉鱼、斑马鱼和西方树蛙更近。根据上述物种系统发生树与OR基因系统发生树的结果,利用Notung2.6分析软件构建了协调树,结果表明所分析的这些OR基因在进化过程中出现178个复制,129丢失。这说明了现存的硬骨鱼类的OR基因都是从它们的共同祖先基因进化而来,在复制与物种分化的过程中基因数目不断扩大,但也有一些基因在进化过程中丢失,或者在这过程中变成了假基因。利用Diverge2.0的分析软件对不同进化分枝中的OR基因功能分化做了分析,结果表明不同进化分枝中的OR基因的功能发生了分化,因此在进化过程中不同家族的OR基因已经形成了不同的功能。最后,利用实时定量PCR的方法,对大黄鱼的不同进化分枝OR基因做了相对表达量的分析,结果发现不同进化分枝中OR基因呈现出不同的表达水平,其中进化分枝K中的OR基因表达水平最高(P<0.01),而进化分枝E中的OR基因表达水平最低(P<0.05)。大黄鱼嗅觉受体基因不同的表达水平,表明不同的受体在日常生活中参与不同的功能。   (4)嗅觉受体的功能研究。为了验证大黄鱼嗅觉受体的功能,我们构建了嗅觉受体在HEK293T细胞中表达的模型,用来检测大黄鱼的嗅觉受体与配体之间的关系。研究结果发现大黄鱼的嗅觉受体基因可以在HEK293T细胞中正确表达。大黄鱼的嗅觉受体对甜菜碱、脂肪酸(C14∶0、C16∶0和C18∶0)、乙醇和前列腺素都有刺激反应。另外研究发现单一的受体能对多种化合物结合,而单一的化合物又可以刺激多种嗅觉受体。所以大黄鱼的嗅觉受体可能通过一定的编码识别过程对外界化合物的感知。   综上所述,大黄鱼嗅觉上皮组织上分布着无数的纤毛与微绒毛,说明其有非常灵敏的嗅觉系统。尽管在大黄鱼嗅觉上皮细胞中,有~100个左右OR基因在表达,但是如何在大黄鱼基因组中选择与调控嗅觉受体基因的表达水平,还需要做进一步的研究。从进化关系来看,大黄鱼的OR基因大黄鱼的嗅觉基因与三刺鱼、红鳍东方鲍和黑青斑河鲍的OR基因更为接近,这也说明了这些鱼类的嗅觉受体基因原本都是从它们的共同祖先中进化。利用HEK293T细胞异元表达的模型,发现大黄鱼嗅觉系统对自然界物质的识别,应该是多种受体协同作用的过程,但在这个过程中如何使用了编码的方式还需要进一步的研究,另一方面受体与配体的结合位点与识别机制还需做详细的研究。
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