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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是机体对血管损伤产生的过度炎症反应所导致的慢性炎症性疾病。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和表型改变是AS的主要病理基础之一,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)作为一种前炎症因子,对炎症反应起着重要的调节作用,在动脉粥样硬化病变中其表达上调,是动脉粥样硬化发病机理中的关键因素之一[1]。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。Syndecan-4作为一种与生长因子结合的共受体(co-receptor),调控多种细胞生物学效应,在细胞的伸展、识别、黏附、迁移和增殖控制中扮演重要的角色,同时也介导炎症反应[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路被认为是细胞外信号引起细胞增殖反应的细胞内信号传递的共同通路[3]。p44/42 MAPK是最重要的MAPK家族成员,是细胞因子、生长因子介导细胞增殖效应中重要的途径之一。姜黄素(curcumin)是姜黄的主要有效成分,许多研究表明,在炎症反应起重要作用的各种慢性疾病中姜黄素能发挥其潜在的治疗作用,目前姜黄素在抗动脉粥样硬化方面的作用尚不十分清楚。阿司匹林(acetylsalicylicacid,aspirin,ASA)是目前临床上抗血小板药物治疗的基石,被广泛用于缺血性心脏病和缺血性脑卒中的一级和二级预防。近年来,阿司匹林非血小板依赖性的抗平滑肌细胞增殖的效用得到越来越多的关注,但对其作用机制尚不是很明确。目的分别以姜黄素(curcumin)和阿司匹林(aspirin,ASA)为研究对象,通过建立体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞模型,分别观察姜黄素和阿司匹林对肿瘤坏死因子-α诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞增殖及对细胞syndecan-4蛋白和磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶(phosph-p44/42MAPK,p-ERK1/2)表达的影响。方法1.细胞增殖的检测:实验一:应用96孔板体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞VSMCs,用终浓度为 20 ng/mL TNF-α 20 μmol/L 姜黄素、20 ng/mL TNF-α 联合 20 μmol/L 姜黄素分别作用24小时,并设立对照组进行比较。同样实验条件重复4次,共215例实验数据,以明确姜黄素是否能抑制TNF-α所诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖。采用MTS/PMS法确定大鼠血管平滑肌细胞VSMCs的增殖状态。实验二:应用96孔板体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞VSMCs,用终浓度为 20 ng/mL TNF-α、1 mmol/L 阿司匹林、2 mmol/L 阿司匹林、20 ng/mL TNF-α+1 mmol/L阿司匹林、20 ng/mL TNF-α+2 mmol/L阿司匹林分别作用24小时,并设立对照组进行比较。同样实验条件重复3次,共180例实验数据,以明确阿司匹林是否能抑制TNF-α所诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖。采用MTS/PMS法确定大鼠血管平滑肌细胞VSMCs的增殖状态。2.Syndecan-4蛋白表达的检测:实验一:体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、20 μmol/L 姜黄素、20 ng/mL TNF-α 联合 20 μmol/L 姜黄素分别作用 24小时,并设立对照组进行比较。裂解细胞提取蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,取适当量蛋白,利用Westemblot蛋白免疫印迹法测定大鼠血管平滑肌细胞VSMCs中syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共12例实验数据。实验二:体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、1 mmol/L 阿司匹林、2 mmol/L 阿司匹林、20 ng/mL TNF-α+1 mmol/L 阿司匹林、20 ng/mLTNF-α+2 mmol/L阿司匹林分别作用24小时,并设立对照组进行比较。裂解细胞提取蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,取适当量蛋白,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定大鼠血管平滑肌细胞VSMCs中syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共18例实验数据。3.磷酸化p44/42MAPK表达的检测:实验一:体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞VSMCs,用终浓度为20 ng/mL TNF-α、20 μmol/L 姜黄素、20 ng/mL TNF-α+20 μmol/L 姜黄素分别作用 24 小时,并设立对照组进行比较。裂解细胞提取蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,取适当量蛋白,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosph-p44/42 MAPK)的表达情况。每组浓度重复实验3次,共12例实验数据。实验二:体外培养SD大鼠血管平滑肌细胞VSMCs,用终浓度为20 ng/mL TNF-α、1 mmol/L 阿司匹林、2 mmol/L 阿司匹林、20 ng/mL TNF-α+1 mmol/L 阿司匹林、20 ng/mL TNF-α+2 mmol/L阿司匹林分别作用24小时,并设立对照组进行比较。裂解细胞提取蛋白,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,取适当量蛋白,利用Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosph-p44/42 MAPK)的表达情况。每组浓度重复实验3次,共18例实验数据。结果1、姜黄素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响:MTS/PMS法测定细胞增殖率,各组细胞的增殖率用OD值表示,各组的增殖率分别为:对照组 1.418±0.172,20ng/mLTNF-α 组 1.615±0.178,20μmol/L姜黄素组 1.438±0.251,20 ng/mL TNF-α 联用 20 μmol/L 姜黄素组 1.484±0.160。统计分析结果表明,与对照组比较,20 ng/mL TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.001),而单独应用20μmol/L姜黄素对大鼠VSMCs增殖无显著作用(P=0.612)。与20 ng/mL TNF-α组比较,20 μmol/L姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的大鼠VSMCs的增殖(P<0.001)。2、姜黄素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响:以对照组目的蛋白与内参灰度值的比值为1,其余各组灰度值分别为:20 ng/mL TNF-α 组 1.353±0.003,20 μmol/L 姜黄素组 1.047±0.035,20 ng/mL TNF-α联用20μmol/L姜黄素组1.008±0.011。统计分析结果表明,与对照组比较,20 ng/mL TNF-α组能显著刺激VSMCs中syndecan-4蛋白的表达(P<0.001),而单独应用20 μmol/L姜黄素对VSMCs中syndecan-4蛋白的表达无显著影响(P=0.079)。与20 ng/mL TNF-α组比较,20μmol/L姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的VSMCs中syndecan-4蛋白的表达(P<0.001)。3、姜黄素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs磷酸化p44/42 MAPK表达的影响:以对照组磷酸化 p44/42 MAPK(p-ERK1/2)与总的 p44/42 MAPK(total-ERK1/2)灰度值的比值为1,各实验组的灰度值如下:20 ng/mL TNF-α组1.297±0.090,20 μmol/L 姜黄素组 1.010±0.046,20 ng/mL TNF-α 联用 20 μmol/L 姜黄素组0.950±0.059。统计结果分析表明,与对照组比较,20 ng/mL TNF-α组能显著刺激 VSMCs 中磷酸化 p44/42 MAPK(p-ERK1/2)的表达(P=0.005);20 μmol/L姜黄素组对VSMCs中磷酸化p44/42 MAPK(p-ERK1/2)的表达无显著影响(P=0.715)。与20 ng/mL TNF-α组比较,20 μmol/L姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的 VSMCs 中磷酸化 p44/42MAPK(p-ERK1/2)的表达(P=0.005)。4、阿司匹林对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响:MTS/PMS法测定细胞增殖率,各组细胞的增殖率用OD值表示,分别为:对照组 1.088±0.086,20 ng/mL TNF-α 组 1.363±0.101,1 mmol/L 阿司匹林组1.103±0.094,2 mmol/L 阿司匹林组 1.087±0.063,20 ng/mL TNF-α 联用 1 mmol/L阿司匹林组1.182±0.064,20 ng/mL TNF-α联用2 mmol/L阿司匹林组1.164±0.060。统计结果分析表明,与对照组比较,20ng/mLTNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.001),1 mmol/L,阿司匹林和2 mmol/L阿司匹林单独作用对大鼠VSMCs的增殖无显著作用(分别为P=0.530,P=0.971)。与20 ng/mL TNF-α组比较,1 mmol/L阿司匹林和2 mmol/L阿司匹林分别能显著抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖(两者均P<0.001)。5、阿司匹林对TNF-α诱导的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响:以对照组目的蛋白与内参灰度值的比值为1,其余各组灰度值分别为:20 ng/mL TNF-α 组 1.449±0.048,1 mmol/L 阿司匹林组 1.002±0.021,2 mmol/L 阿司匹林组 1.005±0.022,20 ng/mL TNF-α 联用 1 mmol/L 阿司匹林组 1.041±0.004,20 ng/mL TNF-α联用2 mmol/L阿司匹林组1.054±0.011。统计结果分析表明,与对照组比较,20 ng/mL TNF-α组能显著刺激VSMCs中syndecan-4蛋白的表达(P<0.001);而单独用1 mmol/L阿司匹林和2 mmol/L阿司匹林与对照组相比对syndecan-4蛋白的表达无显著作用(分别为P=0.866,P=0.701)。与20 ng/mL TNF-α组比较,1 mmol/L阿司匹林和2 mmol/L阿司匹林分别能显著抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs中syndecan-4蛋白的表达(两者均P<0.001)。6、阿司匹林对TNF-α诱导的大鼠VSMCs磷酸化p44/42 MAPK表达的影响以对照组磷酸化 p44/42 MAPK(p-ERK1/2)与总的 p44/42 MAPK(total-ERK1/2)灰度值的比值为1,各实验组的灰度值分别如下:20ng/mLTNF-α组1.341±0.004,1 mmol/L 阿司匹林组 1.004±0.004,2 mmol/L 阿司匹林组 0.995±0.062,20 ng/mL TNF-α 联用 1 mmol/L 阿司匹林组 0.951±0.065,20 ng/mL TNF-α 联用 2mmol/L阿司匹林组0.969±0.107。统计结果分析表明,与对照组比较,20ng/mLTNF-α组能显著刺激VSMCs中磷酸化p44/42MAPK(p-ERK1/2)的表达(P<0.001),1 mmol/L阿司匹林组和2 mmol/1阿司匹林组对磷酸化p44/42 MAPK(p-ERK1/2)的表达无显著作用(分别为P=0.253,P=0.889)。与20 ng/mL TNF-α组比较,1 mmol/L阿司匹林能显著抑制TNF-α所诱导的VSMCs中磷酸化p44/42 MAPK(p-ERK1/2)的表达(P=0.009),2 mmol/L阿司匹林亦能显著抑制TNF-α所诱导的 VSMCs 中磷酸化 p44/42MAPK(p-ERK1/2)的表达(P=0.026)。结论本研究证明了一定剂量的姜黄素和阿司匹林分别能显著抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs的增殖,并能抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs中syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶的表达。因此有必要从细胞和分子水平上进一步研究姜黄素和阿司匹林在防治动脉粥样硬化中的功能角色。