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第一章血管紧张素Ⅱ对NRK-52E中klotho基因表达的影响及Fosinopril和Valsartan干预作用的研究第一节血管紧张素Ⅱ刺激klotho基因表达及valasartan干预作用的研究目的研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激后NRK-52E中klotho基因表达的状况，探讨Valsartan（Val）对klotho基因表达的影响。方法大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）与干预药物共培养。1．按AngⅡ浓度梯度O（对照组），10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol／L培养24小时，选择最佳AngⅡ浓度按时间梯度O（对照组），3，6，12，24小时分组培养，用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）检测klotho mRNA表达水平。2．按Val浓度梯度0（对照组），10-9，10-7，10-5，10-3mol／L分组培养24小时，RT-PCR检测klotho mRNA表达。3．设对照组，AngⅡ(10-7mol／L)组，AngⅡ(10-7mol／L)+Val(10-5mol／L)组和Val(10-5mol／L)组培养24小时，用RT-PCR和免疫组织化学法分别检测klotho mRNA和蛋白表达。结果1．AngⅡ调节NRK-52E中klotho mRNA表达呈量效抑制关系，但在时效关系上，klotho mRNA在3前小时被AngⅡ抑制，较对照组表达降低（P＜0.05），6～12小时klotho mRNA表达量逐渐增加，而24小时后klotho mRNA表达减少，呈明显抑制状态（P＜0.05）。2．不同浓度Val对NRK-52E中klotho mRNA表达与对照组相比无显著差异，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。3．AngⅡ可明显抑制NRK-52E中klotho基因表达（P＜0.05），给予Val阻断AngⅡ作用后，klotho基因表达增高（P＜0.05），而Val本身不影响klotho基因表达（P＞0.05）。小结1．AngⅡ可抑制NRK-52E中klotho mRNA表达，并呈量效依赖关系；2．AngⅡ可抑制NRK-52E中klotho基因表达，阻断AngⅡ后NRK-52E中klotho基因表达上调，提示血管紧张素Ⅰ型受体可能是介导AngⅡ调控klotho基因表达的关键环节。第二节血管紧张素Ⅱ刺激klotho基因表达及Fosinopril干预作用的研究目的研究Fosinopril（Fos）对klotho基因表达的影响，探讨Fosinopril影响AngⅡ下调klotho基因表达的机制。方法NRK-52E与干预药物共培养。1．按Fos(10-5mol／L)时间梯度0（对照组），3，6，12，24小时培养；按浓度梯度0（对照组），10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol／L分组培养24小时，用RT-PCR检测klotho mRNA表达水平。2．设A．对照组，B．AngⅡ(10-7mol／L)组，C．Fos(10-5mol／L)组，D．AngⅡ(10-7mol／L)+Fos(10-5mol／L)组，E．Fos(10-5mol／L)干预12小时后+AngⅡ(10-7mol／L)共培养组，培养24小时，用RT-PCR和免疫组织化学法分别检测klothomRNA和蛋白表达。结果1．Fos对NRK-52E中klotho mRNA表达呈时效依赖关系，随着Fos(10-5 mol／L)干预时间的延长，klotho mRNA表达逐渐增强，在12～24小时klotho mRNA表达较对照组显著增加（P＜0.05），而量效关系不明显（P＞0.05）；2．AngⅡ可抑制NRK-52E中klotho mRNA和蛋白表达（P＜0.05），给予Fos和AngⅡ共同培养，或Fos预先干预后均能抑制AngⅡ下调klotho mRNA表达，与AngⅡ组比较差异具有显著性意义（P＜0.05）。小结1．AngⅡ刺激NRK-52E后其klotho mRNA表达明显下调；2．Fosinopril上调NRK-52E中klotho mRNA表达，并呈时效依赖关系；3．ACEI可以上调NRK-52E中klotho mRNA和蛋白表达，可能是通过抑制AngⅡ而使klotho mRNA和蛋白表达上调。第三节Fosinopril和Valsartan干预后NRK-52E中klotho基因表达状况及klotho与TGF-β1关系研究目的探讨Fosinopril和Valsartan对AngⅡ抑制klotho基因表达的干预作用及klotho与TGF-β1的关系。方法NRK-52E与干预药物共培养。实验分五组，即对照组，AngⅡ(10-7mol／L)组，AngⅡ(10-7mol／L)+Fos(10-5mol／L)组，AngⅡ（10）-7)mol／L)+Val(10-5mol／L)组，AngⅡ（107mol／L）+Fos(10-5mol／L)+Val(10-5mol／L)组，培养24小时后收集细胞进行实验。用RT-PCR检测klotho和TGF-β1 mRNA表达；用免疫组织化学方法和Western Blotting检测klotho和TGF-β1蛋白表达。对klotho和TGF-β1蛋白表达进行直线相关分析。结果1．AngⅡ诱导NRK-52E中TGF-β1 mRNA表达上调，同时使klotho mRNA表达下调，经Fos和／或Val干预后，TGF-β1 mRNA明显受抑制，而klotho显著上调表达（P＜0.05）；Fos+Val联合无增强klotho表达作用，与单纯Fos组和Val组相比无统计学意义（P＞0.05）。2．Fos，Val和Fos+Val均明显上调AngⅡ诱导下的klotho蛋白表达（P＜0.05），同时抑制TGF-β1蛋白高表达（P＜0.05），Fos+Val两者合用较单用Fos组或Val组中klotho和TGF-β1蛋白表达水平无显著性差异（P＞0.05）（图2-3-1）。3．相关分析表明，klotho和TGF-β1蛋白表达呈直线负相关（r=-0.717，P＜0．05）小结1．AngⅡ可诱导NRK-52E中TGF-β1表达上调；2．ACEI和AT1RB可使NRK-52E中klotho基因表达上调，ACEI和AT1RB联合对klotho基因表达无协同叠加作用；3．NRK-52E中klotho基因表达与TGF-β1呈负相关关系。第二章Fosinopril和Valsartan对NRK-52E中Angll-p53／Sp1-klotho信号转导通路的影响目的探讨Fosinopril和Valsartan对NRK-52E中AngⅡ-p53／Sp1klotho信号转导通路的影响。方法NRK-52E与干预药物共培养。实验分五组，即对照组，AngⅡ(10-7mol／L)组，AngⅡ(10-7mol／L)+Fos(10-5mol／L)组，AngⅡ(10-7mol／L)+Val(10-5mol／L)组，AngⅡ(10-7mol／L)+Fos(10-5mol／L)+Val(10-5mol／L)组，培养24小时后收集细胞进行实验。用免疫组织化学法检测p-p38，p38，p53，Sp1和TGF-β1蛋白表达；用RT-PCR和Western Blotting分别检测klotho mRNA和蛋白表达。并对相关指标进行相关分析。结果1．在各组NRK-52E中总p38蛋白表达无显著性差异（P＞0.05），而在AngⅡ组p-p38蛋白表达较对照组显著增高（P＜0.05）；在AngⅡ+Fos组，AngⅡ+Val组和AngⅡ+Fos+Val组p-p38蛋白表达较AngⅡ组降低（P＜0.05），而三组间表达无明显差异（P＞0.05）。2．在AngⅡ组p53和TGF-β1蛋白表达较对照组明显增高（P＜0.05），Fos和／或Val能显著下调AngⅡ诱导的p53和TGF-β1蛋白高表达（P＜0.05）。3．Sp1蛋白在AngⅡ组NRK-52E细胞核中表达较对照组弱（P＜0.05），经Fos，Val和Fos+Val联合干预后，Spl蛋白在AngⅡ+Fos组，AngⅡ+Val组和AngⅡ+Fos+Val组细胞核中表达较AngⅡ组明显增强（P＜0.05）。4．AngⅡ诱导NRK-52E中klotho mRNA和蛋白表达下调（P＜0.05），Fos，Val和Fos+Val干预后klotho mRNA和蛋白表达较AngⅡ组增高（P＜0.05），但三组间klotho mRNA和蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。5．相关分析表明，TGF-β1与p53蛋白表达呈直线正相关关系（r=0.684：P＜0.05）；Sp1与klotho mRNA和蛋白表达均呈直线正相关关系（r分别为0.609和0.502；P＜0.05）。小结1．AngⅡ可诱导NRK-52E中TGF-β1和p-p38上调表达，TGF-β1和p53呈正相关关系，p53可能受TGF-β1激活并参与下游基因的调控；2．转录调控因子Sp1与klotho基因表达呈正相关关系，提示Sp1可能参与对klotho基因表达的转录调控。第三章Klotho基因在自发性高血压模型鼠肾组织中的表达及Fosinopril和Valsartan对其的干预作用目的Fosinopril和Valsartan干预自发性高血压大鼠（SHR），探讨肾素-血管紧张素系统对klotho基因表达的调控及klotho基因在高血压肾间质纤维化中的作用。方法20只22周龄雄性SHR，随机分为4组（5只／组）：高血压组（SHR组），Fosinopril组（Fos组）（Fos 10mg／kg／d灌胃），Valsartan组（Val组）（Val 50mg／kg／d灌胃），Fosinopril+Valsartan组（Fos+Val组）（Fos10mg／kg／d+Val 50mg／kg／d联合灌胃）；22周龄雄性Wistar-Kyoto大鼠（WKY组）5只为对照组。检测各组大鼠体重，尾动脉血压，24小时尿蛋白定量，尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG酶），左肾／体重比值和血肌酐。HE及Masson染色，显微镜下观察肾脏病理改变；用免疫组织化学法检测肾脏组织中klotho和TGF-β1蛋白表达；用RT-PCR和Western Blotting分别检测肾脏组织中klotho，TGF-β1和collagenⅠmRNA和蛋白表达；对相关指标进行相关分析。结果1．实验第8周（30周龄），SHR组收缩压明显高于WKY组，Fos组，Val组及Fos+Val组（P均＜0.05+），而Fos组，Val组及Fos+Val组收缩压与WKY组比较无统计学差异（P＞0.05）；Fos组，Val组及Fos+Val组大鼠血肌酐和尿NAG酶明显低于SHR组（P均＜0.05），而实验前与实验第8周大鼠蛋白尿排泄量差值（△Upro）均高于SHR组（P＜0.05）。2．SHR组大鼠肾脏出现高血压肾脏损害的病理特征，胶原沉积增多，经Fos和／或Val干预后，高血压引起的肾脏改变明显改善。3．免疫组化结果显示，klotho蛋白主要表达于肾近曲肾小管胞浆中。SHR组肾组织klotho蛋白表达较WKY组明显减少（P＜0.05），经Fos和／或Val干预后klotho蛋白表达较SHR组增强（P＜0.05）。TGF-β1蛋白主要表达于肾小管区域。SHR组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达较WKY组显著增高（P＜0.05），Fos和／或Val干预后TGF-β1蛋白表达较SHR组降低（P＜0.05）。4．在SHR组klotho mRNA表达较WKY组明显降低，而TGF-β1和collagenⅠmRNA表达较WKY组显著上调（P＜0.05），Fos组，Val组和Fos+Val组klotho mRNA表达比SHR组显著增强（P＜0.05），同时TGF-β1和collagenⅠmRNA表达明显减少（P＜0.05）。5．在SHR组大鼠肾脏klotho蛋白表达比WKY组显著减少，而TGF-β1和collagenⅠ蛋白表达不同程度上调，Fos组，Val组和Fos+Val组klotho蛋白表达较SHR组增强，同时TGF-β1和collagenⅠ蛋白表达下调（P均＜0.05）；在Fos组，Val组和Fos+Val组三组中，klotho蛋白经Val干预后表达较Fos组和Fos-FVal组增高（P均＜0.05）；TGF-β1和collagenⅠ蛋白在Fos组，Val组和Fos+Val组明显下调（P＜0.05），而三组间无显著差异（P＞0.05）。6．相关分析表明，klotho蛋白与TGF-β1及collagenⅠ蛋白表达呈直线负相关（r分别为-0.566和-0.721，P＜0.05），TGF-β1蛋白与collagenⅠ蛋白表达呈显著直线正相关（r=0.893，P＜0.05）。小结1．SHR模型鼠肾组织klotho基因表达下调，TGF-β1和collagenⅠ表达上调；2．肾组织中Klotho基因表达与TGF-β1和collagenⅠ表达呈直线负相关，提示klotho基因表达下调与肾纤维化有密切关系；3．Fosinopril和Valsartan干预SHR大鼠后其肾组织klotho表达上调，TGF-β1和collagenⅠ表达下调；4．ACEI和AT1RB抗肾纤维化作用可能是通过上调klotho基因表达而实现的。结论1．SHR模型鼠肾脏组织与AngⅡ刺激后NRK-52E中klotho基因出现异常表达；2．TGF-β1—p53／Sp1—klotho可能参与了肾间质纤维化的发生发展过程；3．ACEI和AT1RB除降压作用外，可能通过调节klotho表达状况而发挥保护肾脏功能的作用。