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布鲁氏菌病是由感染人和动物的布鲁氏菌造成的对社会安全有严重危害的疾病,在世界上广泛流行,尤其是在发展中国家,造成更为严重的经济损失。布鲁氏菌是一类兼性胞内寄生菌,其毒力主要依赖于在宿主细胞内的生存和繁殖的能力。二元调控系统(two-component regulatory system,TCS)能够对环境信号感受应答、传递以及处理的信号进行转导、调节和控制。布鲁氏菌有15对TCS,已有研究表明,位于染色体I的TCS与布鲁氏菌的毒力密切相关,但位于染色体II的TCS的毒力表型及其调控机制还尚不清楚。本研究以布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR为研究对象,通过探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌毒力表型、相关基因表达和胞内生存繁殖的影响,及其在小鼠体内的毒力和免疫保护力,为揭示布鲁氏菌感染宿主细胞的分子机制提供线索,也为新疫苗的研发、相关疫病的预防、控制和抗病育种工作提供依据。目的:本研究以羊种布鲁氏菌参考株16M为研究对象,探讨TCS TceSR和TcfSR的功能及其在布鲁氏菌致病过程中的作用机制。(1)构建TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株,并对其进行鉴定。(2)分析TCS TceSR和TcfSR突变株相关毒力基因的胞内外转录水平,比较突变株和亲本株毒力基因表达的差异,根据差异基因的功能及其在突变株中的转录变化,解释突变株相关毒力表型的变化。(3)分析比较突变株和亲本株胞内生存相关表型的差异,确定TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌胞内存活的作用。(4)分析突变株在小鼠体内的毒力,探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌在小鼠体内建立慢性感染的作用。方法:(1)利用同源重组和抗性替换的方法,构建了TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株;对获得的基因突变株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。(2)布鲁氏菌侵染巨噬细胞RAW264.7,qRT-PCR检测布鲁氏菌相关毒力基因(主要包括脂多糖合成相关蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系统、转运系统、鞭毛系统、调控系统、压力蛋白/泛素相关蛋白、氮源代谢分子)的胞内转录水平;亲本株和突变株在体外刺激环境中培养30min。利用qRT-PCR分析毒力基因omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的转录变化。(3)比较突变株和亲本株的胞内存活相关表型。布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,在侵染后不同时间,检测细菌的黏附侵袭能力和胞内存活能力;亲本株和突变株侵染巨噬细胞RAW264.7,利用荧光定量PCR、流式细胞仪和共聚焦显微镜测定宿主细胞在细菌的侵袭下所引起的凋亡和自噬水平;构建能够表达绿色荧光的布鲁氏菌,侵染巨噬细胞RAW264.7,观察布鲁氏菌与溶酶体的融合情况。(4)用布鲁氏菌疫苗株和突变株分别腹腔接种免疫(106CFU)SPF级4-6周龄雌性BALB/c小鼠;接种后的不同时间点采集免疫小鼠血清,采用间接ELISA测定小鼠体内细胞因子IFN-γ的水平和总的IgG水平;无菌分离脾脏,测定脾脏载菌量,制备病理切片,检测突变株的毒力;用105CFU的16M进行攻毒实验,检测各菌株的保护力;克隆、表达、纯化TCES和TCFS两个蛋白,以纯化的蛋白作为抗原,分别对突变株免疫小鼠的血清进行Western Blot分析。结果:(1)成功构建了TCS TceSR和TcfSR启动子突变株16MΔTceSR和16MΔTcfSR,在15代内遗传性稳定;突变株和亲本株的体外生长趋势一致;体外刺激结果显示,突变株对酸、碱、高盐、热应激、营养缺陷和干燥的抵抗力降低。(2)亲本株和突变株侵染细胞24h后,66个布鲁氏菌相关毒力基因在胞内的转录水平发生了变化,其中在16MΔTceSR突变株中,41个(62.12%)基因高表达,25个(37.88%)基因低表达;在16MΔTcfSR突变株中,47个(71.21%)基因高表达,19(28.79%)个基因低表达;在体外刺激环境下,布鲁氏菌胞内存活相关的基因在突变株中的转录水平均低于在亲本株中的转录水平。(3)突变株对细胞的粘附能力和胞内存活能力是减弱的;细胞凋亡研究发现,突变株与亲本株引起宿主细胞凋亡程度相似;而细胞自噬结果却发现,突变株引起细胞自噬水平低于亲本株;溶酶体融合实验显示,侵染细胞24h时突变株组胞内的布氏小体与溶酶体融合率高于亲本株组。(4)突变株免疫小鼠后,可诱导机体分泌IFN-γ和IgG,小鼠脾脏载菌量低于亲本株,但仍存在一定的毒力;攻毒后,突变株免疫的小鼠对亲本株可产生一定的免疫保护力;布鲁氏菌重组蛋白TCES和TCFS可以作为诊断抗原,鉴别突变株免疫和亲本株免疫的小鼠。结论:(1)TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌抵抗逆环境中有重要的作用。(2)TCS TceSR和TcfSR突变株侵染宿主细胞后,66个毒力基因的表达受到了影响,使布鲁氏菌适应胞内的各种不利环境,以利于布鲁氏菌的胞内存活。(3)TCS TceSR和TcfSR突变株在小鼠体内可诱导细胞免疫和体液免疫,其毒力比亲本株下降明显,但需进一步改造。