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D-乳酸作为一种重要的手性中间体和聚合物合成原料,广泛应用于农业、医药和化工等领域。微生物发酵法是D-乳酸工业化生产的主要方法,而利用廉价的木质纤维素原料生产高光学纯度D-乳酸是目前研究的热点。但是存在的问题是很少微生物能够利用木质纤维素水解产物中的五碳糖以及混合糖发酵过程中存在分解代谢产物阻遏效应。为了解决这些问题,本文拟通过基因工程手段构建一株能同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌。本文研究内容及结果如下:(1)以高效利用木糖同型发酵产乙醇的大肠杆菌工程菌E.coli RM10为出发菌株,通过同源重组技术敲除乙醇脱氢酶基因(adh E),并插入D-乳酸脱氢酶基因(ldh A),构建一株能够利用木糖发酵生产D-乳酸的大肠杆菌工程菌E.coli DX02。该菌在10%木糖作为碳源的LB培养基中发酵120 h,D-乳酸产量为84.36 g/L,糖酸转化率为90.97%;在10%葡萄糖作为碳源的LB培养基中发酵28 h,乳酸产量为85.6 g/L,糖酸转化率为90.1%;在10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)作为碳源的LB培养基中发酵时,优先利用葡萄糖,21 h葡萄糖消耗完才利用木糖;发酵114 h时发酵结束,消耗葡萄糖50 g/L,木糖32 g/L,乳酸产量为66.02 g/L,糖酸转化率为80.51%。(2)为了降低混合糖发酵过程中存在的代谢产物抑制作用,通过Red同源重组技术敲除E.coli DX02菌株葡萄糖跨膜转运关键基因pts G,构建一株能同步利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌E.coli DX03。该菌在10%的混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)发酵过程中,同时利用葡萄糖和木糖,有效的利用完葡萄糖和木糖,乳酸产量达到83.04 g/L;相比于出发菌E.coli DX02,木糖利用率提高了56.25%,木糖消耗速度提高了29.41%,乳酸产量提高了25.86%。(3)初步探索了D-乳酸工程菌E.coli DX03利用木糖及其它单糖混合发酵情况。结果表明E.coli DX03利用葡萄糖的能力最强;木糖和L-阿拉伯糖相比于葡萄糖相差很多,两者之间相差较小。以10%混合糖为碳源时,E.coli DX03在LB培养基中发酵时乳酸产量和生产强度最高,改良NBS培养基略低;如果从乳酸产量和生产成本综合考虑,改良NBS培养基更适合工业化生产D-乳酸的要求。