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研究背景:在宿主对结核分枝杆菌(Mtb)感染的免疫机制中,γδ T细胞的作用越来越受到关注和重视。近年研究报道Mtb和卡介苗感染的小鼠模型中分泌IL-17的细胞主要来源于γδ T细胞。本研究室近期的研究也发现活动性肺结核(TB)患者外周血中产生IL-17的γδ T细胞(Tγδ17细胞)的比例明显高于正常健康人。但Tγδ17细胞是属于γδ T细胞的何种亚群,以及肺TB患者的Tγδ17细胞的亚群类别与健康人有何不同,均尚未见报道。另外,虽然对于诱导Th17细胞分化的关键性细胞因子和转录因子已经明确,但是对于诱导Tγδ17细胞分化的细胞因子,转录因子和抗原的调节作用等影响因素的研究很少,尚有待探讨阐明。目的:检测TB患者和健康人(HD)外周血中Tγδ17细胞属于γδ T细胞何种亚群(Vδ1、Vδ2及Vδ3-8亚群)探讨肺TB患者的Tγδ17细胞的亚群类别与健康人有何不同,以及结核杆菌(M.tb)耐热抗原(Mtb-HAg)、磷酸化抗原(HDMAPP)加入细胞因子诱导Tγδ17细胞分化有何不同,以探讨不同淋巴细胞亚群在抗M.tb感染免疫应答和TB发病机制中的作用。方法:1.采集70例活动性肺结核病人、100例HD和33例矽肺患者外周血,加入荧光标记单抗进行表面分子染色,流式细胞仪检测γδT细胞亚群(Vδ1、Vδ2及Vδ3-8亚群)的比例变化。2.采集24例活动性肺结核病人和17例HD外周血,加入佛波醇酯(PMA)和钙离子霉素(Ionomycin)刺激培养2小时后,再加入莫能霉素(Monensin)继续培养4小时,收集细胞,加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色,流式细胞仪检测产生Tγδ17细胞亚群(Vδ1、Vδ2及Vδ3-8亚群)比例及。3.采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),加入Mtb-Hag、HDMAPP和细胞因子(IL-1β、IL-23和TGF-β)培养3天后,加入rIL-2刺激培养9天后,使其成为富含效应性γδ T细胞的细胞群,收集细胞用PMA/Ionomycin和Monensin刺激培养6小时,用流式细胞仪检测Tγδ17细胞亚群的比例。结果:1、TB患者>60岁初治组(n=16)γδ T细胞在T细胞中的比例(5.26%)低于正常人>60岁组(n=23)的比例(6.3%),TB患者<60岁复治组(n=16)γδ T细胞在T细胞中的绝对值(74.52%)低于TB患者<60岁初治组<60岁组(n=34)的绝对值(144.69)(绝对值单位为101/μl)。2、TB患者<60岁初治组(n=32)复治组(n=16)的Vδ2+亚群在总γδ T细胞中比例(60.06%和48.82%)明显低于正常人<60岁组(n=75)的比例(73.68%)(p均<0.01)。TB患者<60岁初治组(n=32)复治组(n=11)的Vδ1+亚群在总γδ T细胞中比例(25.01%和22.61%)明显高于正常人<60岁组(n=75)的比例(11.82%)(p均<0.05)。TB患者>60岁复治组(n=14)的Vδ3-8+亚群在总γδ T细胞中比例(33.17%)明显高于正常人>60岁组(n=21)的比例(14.49%)(p<0.05)。TB患者>60岁初治组(n=14)的Vδ1+亚群在总γδ T细胞中的绝对值(3.71)明显低于TB患者>60岁复治组(n=10)的绝对值(11.71)。TB患者>60岁初治组(n=14)的Vδ3-8+亚群在总γδ T细胞中的绝对值(3.03)明显低于TB患者<60岁初治组(n=32)的绝对值(14.89)(p均<0.05.单位为101/μl)。3、结核病组Tγδ17细胞中以Vδ3-8亚群最多,其次为Vδ2亚群,最少为Vδ1亚群。正常组Tγδ17细胞以Vδ3-8亚群最多,其次为Vδ1亚群,最少为Vδ2亚群。其中正常组γδ T细胞亚群:Vδ1亚群(n=14)、Vδ2亚群(n=18)和Vδ3-8亚群(n=14)的百分比分别为27.31%、10.52%和63.46%,而结核病组γδ T细胞亚群:Vδ1亚群(n=23)、Vδ2亚群(n=24)和Vδ3-8亚群(n=23)的百分比分别为5.03%、10.52%和75.03%。4、从γδT细胞亚群的绝对值上进行比较,正常组中产生Tγδ17细胞的亚群类别中Vδ1亚群与Vδ3-8亚群绝对值相当,而结核病组产生Tγδ17细胞的亚群类别Vδ3-8亚群绝对值急剧升高。其中正常组γδ T细胞亚群:Vδ1亚群(n=14)、Vδ2亚群(n=18)和Vδ3-8亚群(n=14)的绝对值分别为2.46、0.19和2.78,而结核病组γδ T细胞亚群:Vδ1亚群(n=23)、Vδ2亚群(n=24)和Vδ3-8亚群(n=23)的绝对值分别为0.64、0.46和3.7。(单位为101/μl)5、Mtb-Ag+CK组与HDMAPP+CK组在Tγδ17的比例比较中有明显差异,前一组明显比后组升高。Mtb-Ag+CK组与HDMAPP+CK组中Vδ2在Tγδ17所占比例比较中,前者较后者明显降低。结论:1、在正常人中γδ T细胞主要以Vδ2+亚群为主,而在初治结核病、复治结核病以及矽肺患者中,Vδ2+亚群比例降低,而Vδ1+亚群比例增高或Vδ3-8+亚群比例增高。2、TB患者<60岁初治组复治组的Vδ2+亚群在总γδ T细胞中比例明显低于正常人<60岁组的比例。TB患者<60岁初治组复治组的Vδ1+亚群在总γδ T细胞中比例明显高于正常人<60岁组的比例。TB患者>60岁复治组的Vδ3-8+亚群在总γδ T细胞中比例明显高于正常人>60岁组的比例。3、在正常人及TB患者,Tγδ17细胞中均以Vδ3-8亚群最多(60%以上);正常人Tγδ17细胞中Vδ2亚群最少(半数人群检测不到),而TB患者中的Tγδ17细胞中Vδ2亚群明显升高;TB患者的Tγδ17细胞中Vδ1亚群明显低于正常人。4、正常人PBMC,用Mtb-HAg和磷酸抗原(HDMAPP)激活γδT细胞并同时加入含诱导性细胞因子(IL-1β、IL-23和TGF-β)培养(12天)后,均可诱导Tγδ17细胞的分化和增殖。前者诱导产生Tγδ17细胞的数量明显多于后者。但在前者诱导的Tγδ17细胞中,Vδ2细胞数量明显低于后者诱导的Tγδ17。