一、目的：应用两种不同的骨髓细胞成份——BMC和MSC分别进行了治疗大鼠实验性肝纤维化的研究，并对两者的治疗效果进行了对比分析，明确BMC和MSC治疗实验性肝纤维化的有效性，为进一步的临床应用建立实验基础；为今后临床治疗选择干细胞种类提供理论依据。 二、材料与方法： 1.实验动物的选择SPF级Wistat大鼠105只，由南方医科大学动物实验中心提供(许可证号为2002-009，20048023，2004A068)，雌性，4周龄，体重200～300克。其中5只留作空白对照组，100只作肝硬化实验模型用。 F344大鼠5只作提取骨髓干细胞用，由中山大学动物实验中心提供，为SPF级，雄性，2周龄，体重150～200克。F344大鼠购买后即处死提取骨髓干细胞。 所有动物分笼饲养，每笼5只，予以编号，由中山大学动物实验中心SPF级动物实验室饲养在同一有空调的无菌层流架内，每日接受相同时段的光照，食料和饮水不加限制。 2.肝纤维化/肝硬化模型的建立四氯化碳(CCl<,4>)综合法诱导Wistar大鼠肝硬化模型：大鼠注射CCl<,4>前用30﹪酒精灌胃，约3ml/只。每次皮下注射CCl<,4>前均需测量体重，根据体重变化，调整CCl<,4>剂量。第一天给大鼠皮下注射50﹪四氯化碳植物油溶液，剂量为0.6ml/100g体重。4天后给予同浓度的四氯化碳植物油溶液皮下注射，剂量为0.3ml/100mg。以后每周2次行皮下注射，每次剂量均为0.3ml/1.00mg。第5周始每周随机处死1只大鼠观察肝纤维化形成情况，造模至第8周时肝脏病理检查示明显肝硬化改变，造模成功。 3.BMC的采集和分离选用雄性2周龄的SPF级F344大鼠，引颈法处死，70﹪乙醇浸泡消毒1分钟。无菌条件下分离股骨、胫骨，剔尽附着组织，断开骨端，暴露骨髓腔。12号针头在生长面开孔，10ml注射器抽吸．D-Hanks液反复清洗骨髓腔，冲至盛有10﹪FBS培养基的无菌烧杯，吹打成细胞悬液。采用密度梯度离心法分离BMC，首先将淋巴细胞分离液置于试管的底部，然后按照1∶1的比例缓慢将细胞悬液轻轻叠加在淋巴细胞分离液层面上，2000转/分钟离心30分钟。取中层云雾状细胞混悬液，以1∶2体积比加入L-DMEM重悬细胞，1200转/分钟离心10分钟，去上清。细胞沉淀加入10ml L-DMEM重悬，1200转/分钟离心10分钟，去上清，收集细胞。细胞沉淀加入含15﹪FBS的L-DMEM重悬细胞，计数单个核细胞数至6×10<6>个/ml，制成BMC细胞悬液，供移植用。 4.MSC的采集、分离和培养另将部分制成的BMC细胞悬液采用贴壁培养、传代方法纯化出骨髓间质干细胞(MSC)。首先在BMC细胞悬液中加入含15﹪FBS的L-DMEM，调整细胞密度，以2×10<5>个细胞/cm<2>的密度接种于25cm<2>培养瓶中，置于37℃、5﹪CO<,2>饱和湿度的CO<,2>培养箱中培养。培养48小时后半量更换新鲜培养液，以后每隔2-3天换液一次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为原代MSC，记为Pv。接种后约14天，倒置相差显微镜观察贴壁细胞融合达80﹪，采用0.25﹪胰蛋白酶于37℃下消化贴壁细胞3分钟。加入含：FBS的培养基终止消化，PBS轻轻漂洗2次，加含15﹪FBS的L-DMEM，用吸管轻轻吹打成单个细胞悬液，按1∶3的比例重新接种细胞，此为传代培养的第一代，记为P<,1>。倒置相差显微镜观察细胞的生长状况，细胞融合度达80﹪时再传代培养，记为P<,2>，依此类推，记为P<,3>、P<,4>。传至第五代时，在细胞输注给动物模型前，用低糖基本营养基(DMEN-LG)重悬、计数至MSC细胞数为6×10<6>个/ml，制成MSC细胞悬液，供移植用。 5.实验方法与步骤 (1) 骨髓干细胞在肝脏内的定植情况研究取CCl<,4>诱导6周的雌性大鼠5只，乙醚麻醉后，在腹股沟处剪开皮肤，暴露腹股沟静脉，每只大鼠经腹股沟静脉注入3×10<6>个MSC，4周后，处死大鼠，取部分肝组织抽提DNA，以PCR法检测雄性大鼠MSC在雌性大鼠肝脏内的植入情况。另取DMN诱导10天和20天的雌性大鼠各5只，按上述方法注入同样剂量的MSC。在DMN诱导的第49天处死大鼠，取部分肝组织抽提DNA，以PCR法检测雄性大鼠MSC在雌性大鼠肝脏内的植入情况。 MSC的定植检测方法：PCR检测雄性来源的大鼠肝脏Y染色体性别决定区(sex determination region on the Y chromosome，sry)基因在雌性大鼠中的表达。 (2)骨髓干细胞移植治疗实验性肝纤维化的疗效评价 ●动物分组与处理：将肝纤维化/肝硬化成模大鼠60只随机分为6组，分别为BMC<,甲>、BMC<,乙>、MSC<,甲>、MSC<,乙>、NS<,甲>、NS<,乙>，每组10只。采用乙醚吸入麻醉，常规消毒和铺巾后作右上腹旁正中切口开腹，穿刺门静脉并留置硅胶针管，以此作为干细胞移植的通道，根据不同的组别分别输入BMC、MSC和生理盐水(NS)。 -BMC<,甲>组：经门静脉输入0.5ml共计3×10<6>个BMC，移植后继续按造模方法皮下注射CC1<,4>。 -BMC<,乙>组:经门静脉输入0.5ml共计3×10<6>个BMC，移植后不再作任何处理； -MSC<,甲>组:经门静脉输入0.5ml共计3×10<6>个MSC，移植后继续按造模方法皮下注射CCl<,4>。 -MSC <,Z>组：经门静脉输入0.5ml共计3×10<6>个MSC，移植后不再作任何处理； -NS<,甲>组:经门静脉输入0.5ml NS，移植后继续按造模方法皮下注射CCl<,4>。 -NS <,Z>组：经门静脉输入0.5ml NS，移植后不再作任何处理。 ●疗效评价：以上各组大鼠正常喂养4周后处死，抽取血液并离心分离血清5 ml，同时切取右肝叶相同部位2.0克一并保存于-80℃低温冰箱，再取部分右叶肝组织以10﹪福尔马林溶液固定，做常规石蜡切片，HE和Masson染色。分别进行以下指标的检测： -一般情况：包括体重、饮食、活动、毛色、尿色、大便、皮毛、精神状态及存活率以及溃疡的出现与愈合情况； -肝功能指标：包括血清谷丙转氨酶(ALT)、血清谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)和凝血酶原时间(PT)-肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量：样本碱水解法测定肝脏羟脯氨酸含量，图像定量分析测定胶原纤维含量-肝纤维化病理学分级：按2004年中华病理学会的肝纤维化分级标准。 三、结果 1.骨髓干细胞在肝脏内的定植情况PCR分析显示两个模型中的三个治疗组的肝脏内存在雄性供体sry基因的信号，而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号，如下图所示。 2.骨髓干细胞移植治疗实验性肝纤维化的疗效 (1)一般情况治疗组大鼠皮毛仍蓬乱，晦暗，但食欲较前改善，体重缓慢增加，平均为26.57±8.58 g。其行为及反应均较成模时灵敏，无腹泻，旧的溃疡病灶表面较干燥，部分溃疡病灶愈合，未见新的溃疡病灶；而对照组大鼠皮毛蓬乱而无光泽，毛色灰暗，食欲不佳，体重无明显变化，行动及反应仍较迟钝，少数大鼠出现腹泻，皮下溃疡部位未愈合，并出现新的溃疡病灶。 (2) 肝功能在甲组继续皮下注射CCl<,4>时，NS<,甲>组的ALT、AST均明显升高，而MSC<,甲>组ALT、AST明显降低，同时TP、ALB升高，在BMC<,甲>组ALT、AST也有降低，但降低的程度不如MSC <,甲>组，同样TP、ALB也有升高，升高的程度也不如MSC<,甲>。NS <,甲>组、BMC <,甲>组、MSC <,甲>组各组比较有统计学意义(P<0.05)，组间两两(LSD法)比较也有统计学意义(P<0.05)；在乙组未继续皮下注射CCl<,4>时，各组ALT、AST均下降，而且下降至近似正常水平，且三组比较无统计学意义(P>0.05)，TP和ALB升高，升高的三组数据比较也没有统计学意义(P>0.05)；在BMC组、MSC组、NS组各组里，肝功能各指标在BMC<,甲> VS BMC<,乙>，MSC<,甲>VS MSC<,乙>，NS<,甲> VS NS<,乙>，均有统计学意义(P<0.05)。 (3) 大鼠肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量分析两组大鼠肝脏羟脯氨酸及胶原纤维含量发现，在继续皮下注射CCl<,4>情况下，比较各组间差异显示BMC <,甲>组与MSC <,甲>组、BMC <,甲>组及NS <,甲>组间均有统计学意义(P<0.05)，而．MSC <,甲>组与NS <,甲>组间无统计学意义(P>0.05)，见表2。在未继续皮下注射CCl<,4>情况下，进一步比较各组间差异显示三组间均无统计学意义(P>0.05)，见表3。进一步两两之问比较，BMC<,甲> VS BMC<,乙>，MSC<,甲> VSMSC<,乙>，NS<,甲> VS NS <,乙>间均有统计学意义(P<0.05)。