脑胶质瘤是颅内最常见的脑肿瘤,与周围组织分界不清,浸润性生长,目前治疗以手术切除为主,术后辅以放疗、化疗,但效果不理想。胶质母细胞瘤手术治疗后,平均生存时间为12-18个月,一般不超过2年,而且近年来治疗效果毫无进展。寻找新的有效治疗方法成为目前研究热点。近年来,随着免疫学及分子生物学的发展,胶质瘤的基因治疗和免疫治疗受到大家的重视,树突状细胞疫苗成为治疗颅内肿瘤的最有希望的免疫治疗方法。树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知的人体内功能最强大的、专职抗原呈递细胞,能捕获、加工处理抗原,并将抗原信息呈递给淋巴细胞,从而引起一系列免疫反应。目前已有多种DC疫苗在实验中已取得良好的抗瘤效果。致敏DC的抗原有全肿瘤抗原、特异性抗原肽、肿瘤DNA或RNA等。DC最大的功能是能够处理、呈递肿瘤抗原给T淋巴细胞,促使T淋巴细胞识别肿瘤,产生杀瘤效应。目前尚不清楚胶质瘤的特异性抗原和相关抗原,因此DC呈递的抗原激活T淋巴细胞效率低下。脑肿瘤干细胞最早由Ignatova:提出,他发现肿瘤组织中只有少数细胞具有不断分裂增殖倾向,它们具有干细胞的生长特性,因此提出了肿瘤干细胞的概念。这些数量极少具有类似干细胞特性的细胞,它们具有自我更新、无限增殖、多潜能分化能力,是胶质瘤产生和复发的根源。脑肿瘤干细胞表达CD133和Nestin,具有高致瘤性,Singh发现接种100个CD133+细胞就能在小鼠颅内形成肿瘤,而接种105个CD133-细胞也未见肿瘤生长,由此可见胶质瘤干细胞具有很强的抗原性。本实验用C6胶质瘤细胞在无血清培养基中培养,加入细胞因子EGF、bFGF进行诱导,制备胶质瘤干细胞,光镜下观察其形态,免疫荧光检测特异性标志物CD133和Nestin,并进行分化及致瘤性观察。从大鼠骨髓提取单核细胞,加入GM-CSF和IL-4诱导成DC,用胶质瘤干细胞冻融抗原致敏DC制备疫苗,经尾静脉注入荷瘤大鼠体内,能明显延长大鼠的生存时间,病理切片可见较多的CD8+淋巴细胞浸润。研究目的胶质瘤是颅内的恶性肿瘤,手术难以切除干净,术后容易复发,术后放疗、化疗效果不理想,因此有必要寻找新的有效的治疗方法。胶质瘤的免疫治疗受到大家的重视。树突状细胞是目前已知的人体内功能最强大的、专职抗原呈递细胞,树突状细胞疫苗已经进行临床试验,证实安全有效。肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的根源,具有很强的抗原性。本实验用肿瘤干细胞致敏树突状细胞制备疫苗,研究其对荷瘤大鼠的保护作用,为树突状细胞疫苗的临床应用提供理论基础,为胶质瘤的预防和治疗提供新的途径。研究方法1.肿瘤干细胞的培养、鉴定C6大鼠胶质瘤细胞系快速解冻,用含有10%胎牛血清DMEM培养基培养,置于37℃,5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。取对数生长期的C6细胞,接种于无血清培养基中,培养基含2%B27、bFGF 20 ng/ml及EGF 20 ng/ml。免疫荧光检测肿瘤干细胞特异性标志物CD133和Nestin,流式细胞仪检测BTSC表面分子。将10只裸鼠随机分为A、B两组,每组5只,分别于皮下注射肿瘤干细胞及C6细胞,观察肿瘤形成情况,肿瘤切片行HE染色。免疫荧光检测BTSC分化为成熟神经细胞的标志GFAP。2.DC的分离、培养及疫苗的制备在无菌条件下冲洗大鼠骨髓腔,获取组织悬液。用淋巴细胞分离液梯度离心,收集界面层单个核细胞。培养箱中孵育2小时,收集非粘附细胞。加入细胞因子GM-CSF(5ng/ml)和IL-4(5ng/ml),第12d天收获成熟的DC。倒置相差显微镜下观察其形态。将分离好的单细胞悬液离心,加入荧光素标记的小鼠抗大鼠OX62单克隆抗体,另一组试管中加入用同样荧光素标记的同型抗体作为对照,流式细胞仪检测OX62表达情况。制备两种DC疫苗。取对数生长期的肿瘤干细胞及C6胶质瘤细胞,分别悬浮成浓度5×106/ml。反复冻融,裂解物离心,肿瘤抗原与DC以3：1比例混合,37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养18h(抗原量以冻融前肿瘤细胞的细胞数计算,树突状细胞以细胞数计算),即获得DC-BTSC疫苗及DC-C6疫苗。混合淋巴细胞反应：采用大鼠脾脏来源的淋巴细胞作为反应细胞,DC-BTSC、DC-C6及DC作为刺激细胞。分别设立反应细胞及刺激细胞对照组。于酶标仪上490nm处读取OD值,计算刺激指数(SI)。SI=(混合反应细胞孔OD值-刺激细胞孔OD值)/反应细胞孔OD值3.DC疫苗对荷瘤大鼠的治疗作用研究建立C6大鼠胶质瘤模型,将C6细胞注射种植与大鼠右侧尾状核区域。40只成年Wistar大鼠,随机分成A、B、C、D四组,每组10只。7天后A组经尾静脉注射1×107DC-BTSC疫苗(体积100ul)、B组注射1×107DC-C6疫苗、C组为1×107DC,D组为PBS对照,共3次,每次间隔1周。所有荷瘤大鼠死亡后均行病理检查,行HE染色及免疫组化检测CD8+T淋巴细胞浸润情况。生存分析采用Kaplan-Meier方法,生存率比较采用Log-rank检验。结果1.C6胶质瘤细胞在无血清培养条件下,5～7天左右后形成细胞球,细胞多为透亮圆形,悬浮生长,折光性好。从无血清培养基中分离培养的脑肿瘤干细胞进行荧光染色,可见CD133和Nestin染色阳性；在含血清培养基中,肿瘤干细胞分化后GFAP免疫荧光染色亦呈阳性表达。流式细胞仪显示：诱导后的胶质瘤干细胞MHC-Ⅱ、CD80及CD86表达率为60%、51%、62%,显著高于C6胶质瘤细胞的9%、6%、4%。A组接种肿瘤干细胞小鼠皮下可见肿瘤长出。B组接种干细胞完全培养基中的贴壁细胞小鼠未见肿瘤长出。裸鼠成瘤速度与细胞密度密切相关。浓度越高,肿瘤生长越快。取出移植瘤后经HE染色可见典型胶质瘤组织。将BTSC重新接种于含血清培养基中,细胞球逐渐贴壁,四周伸出的许多细小突起；相互连接成网状,贴壁分化的细胞形态与C6细胞一致。2.树突状细胞培养的第2天可见培养基中的单个核细胞贴壁生长,第10天可见悬浮细胞明显增多,细胞体积增大,从胞体周围伸出多个长短不一的树突状突起。流式细胞学检查显示OX62表达阳性率为86%。未经诱导的单个核细胞0X62表达率低。MLR结果显示：相同S:R比例下,DC-BTSC刺激淋巴细胞的增殖指数明显高于DC-C6刺激的增殖指数(P<0.01),并且DC与淋巴细胞比例在1：10时刺激能力最强,淋巴细胞增殖最明显,随着两者比例增大或减少刺激能力减弱。3.立体定向接种胶质瘤后3周,可见大鼠一侧大脑半球上肿瘤组织呈菜花样向外生长,而接种DC-BTSC疫苗组大鼠脑组织未见肿瘤生长。疫苗接种后45天后,取出脑组织行HE染色,A组未见明显肿瘤细胞,其余组可见肿瘤细胞,有不同数量的核分裂相,瘤内坏死。CD8+免疫组化染色见ABC三组均有CD8+T淋巴细胞浸润,其中A组最多,其次为B组,C组散在少量,D组未见CD8+T淋巴细胞浸润。A组中位生存时间为(39±3.12)d,B组为(29±2.01)d,C组为(23±1.42)d,D组为(19±1.02)d。Log-rank检验：4组生存曲线差异总体比较差异有显著统计学意义(P<0.01);A组与B、C、D组分别比较差异均有统计学意义(P<0.05)；B组与C、D组比较差异亦有统计学意义；C、D组比较无统计学意义。结论1.无血清培养基中加入细胞因子EGF、bFGF培养C6胶质瘤细胞,可以获得足够数量的肿瘤干细胞。在含血清培养基中分化后可形成与C6一致的肿瘤细胞。2.诱导后的肿瘤干细胞比诱导前的C6高表达MHC-Ⅱ、CD80、CD86表面分子,抗原性更强。3.肿瘤干细胞和胶质瘤细胞皮下接种裸鼠,可见肿瘤干细胞致瘤能力更强,并且肿瘤生长速度与接种细胞浓度成正比。4.从大鼠骨髓获取DC前体细胞,经淋巴细胞分离液分离后,梯度离心,用细胞因子GM-CSF和IL-4联合培养,可以获得足够数量的DC。5.在同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)中,肿瘤干细胞致敏的DC与胶质瘤细胞致敏的DC相比,刺激指数更高,S:R=1:10时,刺激指数最强。6.胶质瘤干细胞抗原致敏的DC疫苗接种大鼠后,能够诱导机体的免疫反应,抑制C6胶质瘤的生长,延长大鼠的生存时间。7.胶质瘤干细胞抗原致敏的DC疫苗对大鼠具有良好的免疫保护作用,其效果优于胶质瘤细胞致敏的DC疫苗及未经抗原致敏的DC,为胶质瘤的免疫治疗提供了新的途径。