研究目的肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内第五大常见癌症,其致死率居第三位,全球每年约50万人死于HCC。其主要致病因素是乙型及丙型肝炎病毒感染,此外长期酗酒、黄曲霉素感染、脂肪肝等因素也会导致肝癌的发生。HCC发生与进展的分子机制目前尚未完全阐明,因此对其进行深入探索将为从分子水平对肝癌进行早期预防和干预奠定基础。AIM2(Absent in melanoma 2)是干扰素诱导的HIN-200蛋白家族中的一员,其作为一种胞内DNA感受器,在固有免疫中发挥重要作用,近年来的研究显示,AIM2也能够影响肿瘤的发生与进展。AIM2对肝细胞肝癌的进展是否发挥效应及其作用机制目前尚不明确。本课题深入研究了AIM2在对肝细胞肝癌进展过程中的作用效应,并初步探讨了其分子机制。该研究证实AIM2表达缺失通过激活mTOR-S6K1信号通路促进肝细胞肝癌的进展,为肝细胞肝癌的分子靶向治疗提供了新思路。材料和方法1.肝细胞肝癌组织及其配对非癌肝组织中AIM2表达情况监测1.1免疫组化染色应用49例肝癌及其对应的远端非癌肝组织的石蜡切片,对AIM2分子进行免疫组织化学染色,检测其在肝癌细胞中的表达定位与表达水平。1.2 Western blot检测应用Western blot的方法检测64例肝癌患者的肝癌组织及其配对非癌肝组织中AIM2蛋白的表达水平。应用Image J软件对肝癌组织及其对应的非癌肝组织中AIM2表达条带进行定量分析,并应用Graph Pad Prism5.0软件对条带灰度进行统计学分析。1.3 Real-time PCR检测应用Real-time PCR检测64例肝癌组织及其配对非癌肝组织中AIM2 mRNA的表达水平,并进行统计学分析。2.AIM2对肝癌细胞生物学活性的影响2.1肝癌细胞系的筛选应用Western blot的方法检测HepG2、HUH7、BEL7402、SMCC7721、 MHCC97H和MHCC97L六种肝癌细胞系中AIM2的相对表达量。2.2 AIM2过表达细胞模型的构建向SMCC7721和HUH7肝癌细胞系中转染AIM2表达质粒,并以空白载体转染组作为对照,转染24h后,应用Western blot的方法在蛋白水平验证AIM2是否高表达,以此判定AIM2过表达细胞模型构建是否成功。2.3检测过表达AIM2对肝癌细胞增殖,克隆形成和迁移侵袭能力的影响在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中,应用CCK-8、克隆形成实验和Transwell实验分别检测AIM2过表达对肝癌细胞增殖、克隆形成能力和侵袭转移能力的影响。2.4 AIM2表达受抑制的细胞模型的构建2.4.1 AIM2特异性Si-RNA的筛选向肝癌细胞系中分别转染合成的三条靶向AIM2的小干扰RNA(Si-AIM2),并以非特异性无义序列(Si-NC)转染组作为对照,筛选出两条干扰效率达80%以上的Si-AIM2,,用于构建AIM2表达受抑制的细胞模型。2.4.2 AIM2表达受抑制的细胞模型的构建向BEL7420和HepG2肝癌细胞系中分别转染Si-AIM2以干扰AIM2的表达,并以Si-NC转染组作为对照。应用Western blot在蛋白水平验证是否有效干扰AIM2的表达,以此判定AIM2表达受抑制的细胞模型是否构建成功。2.5 AIM2表达受抑制对肝癌细胞生物学活性的影响在成功构建的AIM2表达受抑制的细胞模型中,通过CCK-8法和克隆形成实验检测干扰AIM2表达对肝癌细胞增殖和克隆形成能力的影响；通过Transwell实验,检测干扰AIM2表达对肝癌细胞迁移和侵袭转移能力的影响。3.AIM2炎症小体激活的相关检测3.1在AIM2过表达的细胞模型和AIM2表达受抑制的细胞模型中检测AIM2依赖性炎症小体是否活化分别在成功构建的AIM2过表达和表达受抑制的细胞模型中,应用Westernblot检测炎症小体活化后下游效应分子Caspase-1和IL-β的剪切,以此来判断AIM2炎症小体的形成与活化。3.2检测AIM2过表达细胞模型中IL-1β以及Caspase-1的剪切在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中,应用ELISA分别在0h,12h,24h,36h和48h检测IL-1β的剪切；在上述时间点,应用Caspase-1底物剪切试剂盒检测Caspase-1的剪切。3.3 AIM2依赖性炎症小体激活后的细胞焦亡检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放实验是用于检测炎症小体活化后发生细胞焦亡的经典方法。在成功构建的AIM2过表达细胞模型中,应用LDH释放实验分别在0h,24h,36h和48h检测乳酸脱氢酶的释放量,进一步确定细胞是否发生炎症小体激活后的细胞焦亡(Pyroptosis)。4.AIM2对肝癌细胞作用效应的机制研究4.1 AIM2过表达的细胞模型中信号转导通路的筛选在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中,Western blot检测AIM2过表达后mTOR、AKT、NF-KappaB等信号通路的变化,以筛选AIM2发挥效应的关键信号通路。4.2 AIM2表达受抑制的细胞模型中信号转导通路的筛选在成功构建的AIM2表达受抑制的细胞模型中,Western blot检测AIM2过表达前后mTOR、AKT、NF-kappaB等信号通路的变化,以进一步反向验证AIM2过表达的实验结果。4.3验证AIM2是否通过抑制mTOR-S6K1信号通路对HCC发挥抑癌效应在成功构建的AIM2表达受抑制的细胞模型中,抑制mTOR-S6K1信号通路的活化,应用CCK-8、克隆形成以及Transwell等实验,验证mTOR-S6K1通路封闭以后,能否逆转AIM2缺失对HCC的促进效应。5.构建裸鼠异种移植瘤模型,验证AIM2对HCC的抑癌效应5.1裸鼠异种移植瘤模型的构建肝癌细胞系BEL7402和SMCC7721(1×107)皮下接种于裸鼠(雄性,4-6周)左腋内侧,待出现肉眼可见的肿瘤后,开始在瘤内注射30ugAIM2质粒,同时在对照组瘤内注射30ug空载体,隔天注射一次。注射25天后,处死小鼠,分离肿瘤,验证AIM2对肝细胞肝癌的作用效应。5.2验证肿瘤内AIM2是否成功过表达将剥离出的肿瘤组织提取RNA和蛋白质,应用Real-time PCR和Western blot检验肿瘤组织内是否成功过表达AIM2。5.3比较实验组与对照组中肿瘤的体积、重量将剥离的肿瘤组织称取重量,量取肿瘤体积,比较分析实验组和对照组之间肿瘤的体积和重量差异。5.4在肿瘤组织中进一步验证信号通路用Western blot检测mTOR信号通路中相关分子的磷酸化水平的变化,以验证细胞系实验结果。研究结果1.与非癌肝组织相比,AIM2在肝癌组织中的表达显著下调1.1免疫组化结果显示,AIM2在HCC组织中的表达显著下调免疫组织化学染色结果显示,与癌旁组织相比,AIM2在肝癌组织中的染色强度明显降低。进一步研究发现AIM2与性别、年龄、肿瘤大小等指标之间不相关,但与病理分级、临床分期之间呈显著性负相关(**P<0.01)。以上结果提示,AIM2在HCC的表达量显著降低,其缺失表达可能促进HCC疾病的恶性进展。1.2 Real-time PCR结果显示,AIM2 mRNA在HCC的表达量显著下调应用Real-time PCR的方法对64例肝癌患者中肝癌组织及对应的远端非癌肝组织中的AIM2 mRNA的表达水平进行检测。结果显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中AIM2在mRNA的表达水平显著下调(*P<0.05)。1.3 Western blot结果显示,AIM2的蛋白水平在HCC的表达量显著下调应用Western blot对64例肝癌患者中肝癌组织及对应的远端非癌肝组织中AIM2蛋白表达水平进行检测。结果显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中AIM2蛋白的表达显著下调(**P<0.01)。1.4 AIM2蛋白的表达缺失可促进HCC的恶性进展Western blot的统计分析结果显示,AIM2的表达与性别、年龄等指标无显著性相关关系,但与肿瘤大小、临床分期以及是否发生转移之间呈显著性负相关(*P<0.05,*P<0.05,P**<0.01)。2.AIM2抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成以及侵袭能力2.1肝癌细胞系的筛选Western blot结果显示,SMCC7721和HUH7肝癌细胞系中AIM2的相对表达量较高,用于构建AIM2过表达的细胞模型；BEL7402和HepG2肝癌细胞系中AIM2的表达量相对较高,用于构建AIM2表达受抑制的细胞模型。2.2 AIM2过表达细胞模型中,肝癌细胞的恶性行为受到抑制与空载体转染组相比,AIM2质粒转染组的肝癌细胞的增殖能力和克隆形成能力均显著降低；同时,其迁移、侵袭能力显著降低。2.3 AIM2表达受抑制的细胞模型中,肝癌细胞的恶性行为显著增强在成功构建的AIM2表达受抑制的细胞模型中,与Si-NC转染组相比,Si-AIM2转染组的肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力均显著提高。3.AIM2通过促进炎症小体的形成诱导细胞焦亡AIM2作为DNA感受器,可以通过结合ASC以及Caspase-1而形成AIM2-ASC-Caspase-1炎症小体,通过诱导形成焦亡小体,使细胞发生焦亡。3.1 AIM2过表达细胞模型中,AIM2依赖性炎症小体被激活在成功构建的AIM2过表达细胞模型中,与空载体转染组相比,AIM2质粒转染组中Pro-Caspase-1和Pro-IL-1p的剪切均显著上调,提示AIM2依赖性炎症小体的形成和活化。3.2 AIM2表达受抑制的细胞模型中,AIM2依赖性炎症小体受到抑制在AIM2表达受抑制的细胞模型中,Pro-Caspase-1和Pro-IL-1β的剪切均显著下调,提示AIM2依赖性炎症小体受到抑制。3.3 AIM2炎症小体对Pro-Caspase-1和Pro-IL-1p的剪切存在时间依赖性在成功构建的AIM2过表达细胞模型中,Caspase-1底物检测实验和IL-1pELISA实验表明,Caspase-1和IL-1p的能够发生时间依赖性的剪切和活化。3.4 AIM2依赖性炎症小体激活后引起细胞焦亡在成功构建的AIM2过表达细胞模型中,LDH释放实验表明,AIM2转染组中LDH的释放量显著增多,提示AIM2的过表达能够促进炎症小体的形成,并进一步诱导细胞发生焦亡。3.5炎症小体抑制剂能够有效抑制AIM2的抑癌效应在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中,加入炎症小体抑制剂,抑制炎症小体的形成,AIM2对肝癌细胞抑癌效应被有效逆转。4.AIM2通过抑制mTOR-S6K1信号通路抑制肝细胞肝癌的进展4.1 AIM2抑制mTOR-S6K1信号通路的活化在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中,Western blot检测结果显示,包括p-mTOR,p-S6K1,p-S6以及p-4E-BP1等mTOR-S6K1信号通路分子的磷酸化水平均显著降低；而在AIM2表达受抑制的细胞模型中,mTOR-S6K1信号通路分子的磷酸化水平显著降低。以上结果提示,AIM2能够有效抑制mTOR-S6K1信号通路的活化。4.2 AIM2抑制HIF-1a表达HIF-1a是mTOR-S6K1信号通路的下游分子,我们进一步检测了AIM2对HIF-1a的影响。在AIM2过表达细胞模型中,Western blot检测到低氧诱导因子1-a (HIF-1a)的表达水平也显著降低。而在AIM2表达受抑制的细胞模型中,HIF-1a的表达水平显著升高。4.3 AIM2通过炎症小体依赖的方式抑制mTOR-S6K1信号通路的活化在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中,加入炎症小体抑制剂。在炎症小体被有效抑制后,mTOR信号通路的相关分子p-S6,p-4E-BP1的磷酸化水平显著提高,提示,AIM2抑制mTOR-S6K1的作用被逆转。以上结果说明,AIM2以炎症小体依赖性方式抑制mTOR-S6K1通路的活化。4.4 AIM2通过抑制mTOR-S6K1信号通路的活化对HCC发挥抑癌效应在AIM2表达受抑制的细胞模型中,加入mTOR通路的抑制剂后,肝癌细胞的恶性行为被有效逆转。以上结果均提示,AIM2通过抑制mTOR-S6K1信号通路的活化抑制肝细胞肝癌的进展。5.AIM2有效抑制裸鼠异种移植瘤的生长裸鼠成瘤模型构建成功后,瘤内注射AIM2表达质粒,并以空载体注射组作为对照。注射25天后处死小鼠,分离肿瘤。结果显示,AIM2注射组的肿瘤体积、大小和重量均显著低于对照组。Western blot结果显示,与对照组相比,AIM2注射组中mTOR-S6K1信号通路蛋白磷酸化水平显著降低。以上结果进一步验证,AIM2通过抑制mTOR-S6K1信号通路对HCC发挥抑癌效应。结论1.肝癌组织中AIM2在mRNA和蛋白水平的表达均显著下调,并与肝癌的病理分级和临床分期呈显著性负相关。2.AIM2能够显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力,从而抑制其恶性行为。3.AIM2通过诱导炎症小体的形成抑制mTOR-S6K1信号通路的活化,从而抑制肝细胞肝癌的进展。创新点及意义1.本课题首次发现,AIM2在肝细胞肝癌中的表达下调和缺失促进了肝癌的进展。2.本课题首次报道了AIM2分子对mTOR-S6K1调控效应。3.本课题首次提出AIM2通过形成炎症小体,抑制mTOR-S6K1信号通路的活化,从而发挥对肝细胞肝癌的抑制作用。