荧光光谱法由于具有灵敏度高、试样用量少、仪器设备简单、操作简便、可实现原位实时在线及非破坏性检测等优点而在分析化学、环境化学、食品化学、生物化学、临床医学等领域显示出越来越广阔的应用前景。然而直接荧光光谱分析仅适用于自身有荧光信号的物质的分析,对于自身没有荧光信号的物质的分析则需要采用荧光探针分析技术。荧光探针可粗略分为强度型荧光探针、比率型荧光探针和广义比率型荧光探针三类。相对于强度型荧光探针,比率型和广义比率型荧光探针具有抗光漂白性强、受荧光光源强度及荧光探针载入量的变化影响小等优势而具有更为广泛的应用。使用比率型和广义比率型荧光探针进行定量分析时,一般采用基于两个特征波长处荧光信号强度比值的传统单变量比率模型。传统单变量比率模型通常只适用于不存在荧光干扰物质的简单均相体系,不适用于复杂非均相体系。复杂非均相体系中存在的散射颗粒物质、吸光物质以及可能存在的荧光干扰物质等均会严重影响传统单变量比率模型的定量分析结果。针对这一问题,本学位论文拟利用比率型及广义比率型荧光探针的特点建立适用于复杂非均相体系中待分析物定量测定的新型荧光定量分析模型,实现复杂非均相体系中待分析物的直接准确定量检测。本学位论文主要研究内容如下:1.比率型荧光探针结合新型荧光定量分析模型用于混浊体系中游离Mg²⁺的直接定量分析（第2章）Mg²⁺是生命体中重要的无机矿物盐之一且几乎存在于每一种生物有机体的各种细胞中,Mg²⁺也是调节各种生物化学反应的300多种酶类的辅助因子,因此对细胞内Mg²⁺的检测具有非常重要的意义。荧光光谱技术结合Mg²⁺荧光探针是目前应用最广泛的细胞内游离Mg²⁺检测技术之一。然而Mg²⁺荧光探针（如:Mag-Indo-1）常常能与Ca²⁺结合,且与Ca²⁺的结合产物具有更低的解离常数而干扰Mg²⁺的定量测定。针对这一问题,本章发展了新型荧光定量分析模型,并将其与Mg²⁺荧光探针Mag-Indo-1相结合,应用于有Ca²⁺共存干扰的混浊样本中游离Mg²⁺的定量测定。实验结果表明:新型荧光定量分析模型能够很好地消除Ca²⁺的共存干扰,实现混浊体系中游离Mg²⁺的准确定量分析。新型荧光定量分析模型对有Ca²⁺共存干扰的混浊体系中游离Mg²⁺的定量分析结果的平均相对预测误差约为6.0%,与原子吸收分光光度法的定量分析结果的准确度之间没有显著性差异。本章结果表明:在比率型荧光探针对待分析物的选择性不是很高的情况下,可以通过应用先进的荧光定量分析模型来实现有性质相似的共存干扰物质存在的样本中待分析物的准确定量分析。2.广义比率型荧光探针结合新型荧光定量分析模型用于混浊体系中待分析物的定量分析（第3、4章）虽然比率型荧光探针相对于强度型荧光探针定量来说有诸多优势,但比率型荧光探针的设计和合成机理复杂,合成过程繁琐,限制了其更广泛地应用。本学位论文第3章将对待分析物NO2-敏感的强度型荧光染料吲哚与对其无响应的惰性荧光物质维生素B6组合成NO2-的广义比率型荧光探针,并将其与新型荧光定量分析模型相结合用于模拟混浊体系和实际样中NO2-的直接定量测定。实验结果表明,广义比率型荧光探针结合新型荧光定量分析模型能够对复杂样本中NO2-进行准确的定量分析,其平均相对预测误差为4.5%,检测限和定量限分别为1.3和3.9ng/m L。该方法具有简便、快捷、不需要对样本进行任何前处理等特点,能够实现复杂非均相体系中待分析物的进行直接定量分析。本学位论文第4章通过将与肾上腺素发生反应生成具有强荧光信号产物的邻苯二胺与对肾上腺素无响应的荧光染料丁基罗丹明B一起组成肾上腺素的广义比率型荧光探针,然后将所组成的广义比率型荧光探针与新型荧光定量分析模型相结合应用于未经任何预处理的血浆样中肾上腺素的定量分析。实验结果表明,本章发展的新方法能对未经任何预处理的血浆样中肾上腺素进行准确定量检测,其定量分析结果的平均相对预测误差小于8%,与LC-MS/MS对照实验的准确度相当。血浆含有的血浆蛋白和其他干扰物质对本章发展的定量分析模型准确定量的性能没有显著影响。3.基于PEBBLEs技术的广义比率型纳米荧光探针结合新型荧光定量分析模型用于混浊体系中待分析物的定量分析（第5、6章）将强度型荧光探针与惰性荧光物质组合成广义比率型荧光探针能在一定程度上扩展强度型荧光探针的应用范围。但由于难以保证两种荧光物质在细胞或生物组织中载入量的比率不变,上述广义比率型荧光探针不适用于细胞或生物组织等复杂体系中待分析物的定量分析。将对待分析物响应灵敏的强度型荧光探针和对其无响应的惰性荧光染料同时包裹于无毒惰性材料空腔内而合成的PEBBLE（Probe Encapsulated by Biologically Localized Embedding）纳米荧光探针能够保证两种荧光染料在细胞内载入量的比率保持不变。基于PEBBLEs技术的广义比率型纳米荧光探针可适用于细胞或生物组织等复杂体系中待分析物的定量分析。传统方法中,通常采用单变量比率模型结合基于PEBBLEs技术的广义比率型纳米荧光探针对待分析物进行定量分析。然而单变量比率模型却不适用于各种复杂非均相体系中待分析物的定量分析。因此,本学位论文第5章将基于PEBBLEs技术的广义比率型纳米荧光探针（通过荧光探针Rhod-2与曙红B包裹于PEBBLEs内构建而成）与新型荧光定量分析模型相结合用于模拟及实际非均相混浊体系中游离Ca²⁺的定量分析。实验结果表明,本章发展的方法能够实现复杂非均相混浊体系中游离Ca²⁺的准确定量测定。对于实际非均相体系,本工作提出的新型荧光定量模型定量结果的平均相对预测误差约为2.7%,回收率在93.1%¹01%之间,且与原子吸收分光光度法对照实验的结果相当。由于PEBBLEs合成应用中对包裹于其内部对待分析物无响应的惰性参比物质选取的要求十分严苛,使得荧光参比物质的选取十分困难而限制了PEBBLEs纳米荧光探针的广泛应用。而后我们在实验过程中发现,碳量子点（C-dots）具有水溶性强、荧光稳定性好、荧光量子产率高、激发发射波长可调性强、粒径小、毒性低、生物相容性好等诸多优点。因而,本学位论文第6章将稳定的C-dots和对待分析物敏感的强度型荧光探针Rhod-2同时包裹于稳定的聚丙烯酰胺纳米囊内,首次制备出广义比率型荧光纳米探针C-PEBBLEs,并将其与新型荧光定量分析模型相结合应用于实际复杂非均相体系中游离Ca²⁺的准确定量测定。实验结果表明,本章提出的新方法对实际复杂非均相体系中游离Ca²⁺定量分析结果的平均相对预测误差小于4%,媲美于原子吸收分光光度法定量分析结果的精确度。