目的：采用多种方法分离提取水蛭中有效成分，对其抗凝活性及作用环节进行研究，并追踪其最强有效成分，同时，探讨最强活性成分的作用机制。 方法： 水蛭提取分离与鉴别 1.水蛭乙醇回流-萃取法：水蛭粗粉分别用95％乙醇回流提取3次，合并3次提取液，用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇，加蒸馏水100ml溶解，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，剩余为水溶液部分。再分别用旋转蒸发仪浓缩，回收石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水，真空干燥，得四部分干燥品 2.薄层色谱法：铺板，硅胶G：羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。点样，样品溶液的溶剂是甲醇，点好样的薄层板用电吹风的热风吹干。配制相应展开剂，控制温湿度，等展开系统的饱和，跑板，显色。 3.柱层析法：选柱(1.7cm×30cm)，装柱，选择硅胶(300-400目)200ml，干法装柱。水蛭乙酸乙酯提取部分用少量流动相溶解，与少量硅胶混合均匀，吹干，上样。分级洗脱，A：B=2：1、1.5：1、1.1、1:2洗脱(A液：将甲苯、乙酸乙酯、丙酮按4：2：3混匀的混合液；B液：甲醇)。自动收集器收集(1管/小时)。鉴别，合并具有相同成分的收集液，活性检测。 4.高速逆流色谱法：用输液泵以10ml/min的流速将固定相注满螺旋管柱，排尽柱内空气.启动HSCCC主机，调节转速为800r/min，由首端向尾端，以1ml/min的流速向柱中泵入流动相。当流动相从主机出口流出，证明体系已经达到流体动力学平衡，此时对检测器和记录仪调零，走基线。再将水蛭乙酸乙酯提取部分样品溶液打入进样环。柱口流出物通过紫外检测器在254nm下连续检测，记录仪同步记录，根据谱峰收集组分。 抗凝血活性测定 1.凝血酶原时间(PT)的测定：取血浆(孵育3分钟)100μl加入到测试槽中，加入水蛭药液25μl，预热3分钟后加入已预热10分钟的PT试剂，用血凝仪测定凝固时间，记录。 2.活化的部分凝血活酶时间(APTT)的测定：取血浆(孵育3min)100μl加入到测试槽中，加水蛭药液2μl和已预温10分钟的APTT试剂100μl，预温，加入预温10min的CaCL2100μl，用凝血仪测定凝凝血。 3.凝血酶时间(TT)的测定：取血浆(孵育3分钟)100μl加入到测试槽中，加入水蛭药液25μl，预热3分钟后加入已预热10分钟的TT试剂，用血凝仪测定凝固时间，记录。 4.测定纤维蛋白原凝固时间(FibrinogencoagulationtimeFCT)：分别取药液100μl加入到已经加入纤维蛋白原(2.5mg/ml)100μl的测试槽中，预温5分钟，再加入预温10分钟的凝血酶(13U/ml)，用凝血仪测定凝固时间，记录。 5.测定血小板聚集功能(plateletactivationassayPAA)：在测定样品方杯中加入一小磁棒和300μlPRP置恒温孔中预热5分钟。在另一方杯中加入300μlPPP。在测试通道中插入PPP方杯，按确认键检测零点，取出PPP方杯放入PRP方杯，按确认键窗口显示ADP。用微量进样器吸取3μlADP加入杯底，按确认键仪器进入测试血小板聚集状态，窗口显示计时时或血小板最大聚集率。测试完毕后仪器自动打印出结果及相应曲线。 结果： 1.水蛭石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分外对人PT、APTT、TT均有延长在作用，其中，在同一浓度乙酸乙酯部分对PT、APTT、TT显著延长(P=0.000,0.008，0.000)，均数分别为：47.77±4.56s，346.35±78.86s，372.67±25.37s，对照组分别为：24.43±1.92s，157.67±16.60s，81.40±2.08s；对FCT的作用也是乙酸乙酯部分最显著(P=0.001)，均数分别为：水蛭组263.55±60.11s，对照组27.53±0.90s。 2.水蛭乙酸乙酯部分用HSCCC继续分离，薄层鉴定，其结果是3号峰较纯，活性测定表明，对FCT的作用(水蛭分离组82.43±25.65s，对照组40.03±5.08s)有显著统计学意义(P=0.043)。 3.水蛭乙酸乙酯部分用柱色谱继续分离和薄层鉴定，其结果是3～11管比较纯，斑点相同，对FCT的作用(14.18±0.65s，对照组9.03±0.15s)有统计学意义(P=0.024)。 4.水蛭乙酸乙酯部分和凝血酶混合，透析，做FCT分析，其结果具有统计学意义(P=0.000)，均数为：透析组15.03±0.93s，对照组10.23±0.48s。 5.水蛭乙酸乙酯部分再用水萃取并做血小板聚集实验，体外实验(药物浓度分别为5.6mg/ml,2.8mg/ml，1.4mg/ml)表明具有抑制血小板聚集作用(P<0.01)，其最大聚集抑制率分别为75％，47％，15％；家兔体内实验(67mg/ml/kg)也具有抑制血小板聚集作用(P<0.01)，给药25min，90min后其最大聚集抑制率分别为23％，6％。 结论： 1.水蛭提取物石油醚部分，正丁醇部分，乙酸乙酯部分，水部分均有抗凝血作用，其中乙酸乙酯部分作用最强。水蛭的乙酸乙酯提取部分能使人的血浆PT、APTT、TT、FCT显著延长，其延长率分别达为95.53％、119.67％、375.83％、857.53％。 2.我们对乙酸乙酯部分进行了活性追踪发现，水蛭乙酸乙酯部分存在有抑制凝血酶活性的成分，其机制是：抑制凝血酶活性，使血小板聚集能力下降，具有抗凝血，抗血栓作用。