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联合应用组胺和4-氨基吡啶(4-AP)复合因素建立瘙痒模型,对其搔抓行为学、局部组织变化进行观察,运用血清ELISA方法观测其对几种与瘙痒相关细胞因子的影响,并与传统的单因素致瘙痒模型进行比较;使用建立的动物模型考察薄荷醇的止痒作用以及与常用止痒药物马来酸氯苯那敏和醋酸曲安奈德分别联用时的止痒效果及对后二者止痒活性的影响,推测其可能的机制;采用马来酸氯苯那敏作为模型药物,采用小鼠皮肤在双室扩散池上进行体外透皮实验,考察薄荷醇在体外对模型药物马来酸氯苯那敏的促透皮吸收作用,及其对该药皮肤贮库效应的影响。
方法
1.复合因素致瘙痒模型的建立
小鼠随机分为4组,在脱毛部位皮下注射造模药物后观察30min,计30min.内搔抓反应次数和搔抓潜伏期。记录结束后立即摘眼球取血并制备血清,依ELISA试剂盒要求操作检测小鼠血清中组胺、IFN-γ和IL-6的浓度,并进行统计学分析;取注射部位周围皮肤切成小块进行病理切片并用HE染色,观察局部组织有无明显的形态学差异及真皮中炎细胞的数量及形态差异。
2.薄荷醇的止痒作用及其对瘙痒有关的细胞因子的影响
小鼠随机分为5组。于皮下注射造模药物前各组分别于待注射部位涂抹治疗药物,实验方法同复合因素致瘙痒模型的建立方法研究,观察各剂量薄荷醇组的止痒作用,并推测其可能的作用机制。
3.薄荷醇对常用止痒药物止痒作用的影响
小鼠随机分为5组。于皮下注射造模药物前各组分别于待注射部位涂抹治疗药物,实验方法同复合因素致瘙痒模型的建立方法,观察应用和不应用薄荷醇的止痒药物组之间的区别以判断薄荷醇对止痒药物止痒作用的影响,并推测其可能的作用机制。
4. 薄荷醇对常用止痒药物的促透作用研究
将去毛的小鼠背部皮肤的皮下组织剥离干净,固定于双室扩散池上,皮肤固定于样品池与接受池之间,角质层面向样品池。分5组进行透皮实验和贮库效应实验。根据透皮实验的结果判断薄荷醇对马来酸氯苯那敏的体外促透皮吸收作用,根据贮库效应的结果推断其可能机制。
4.1透皮实验
接受池注入5mL接收液,样品池注入0.1mL释放液,旋紧瓶口后竖直放置在气浴恒温振荡器上恒温振荡。在2、4、8、12、24h分别取接收液4mL,同时补回4mL磷酸缓冲溶液(pH=7.4),取出的接收液稀释适当倍数后,用752型紫外分光光度计在260nm测A值,根据标准曲线测定模型药物的浓度。对数据进行计算得出透皮实验各组的渗透速率和滞后时间。
4.2贮库效应实验
在透皮实验24h时间点取样结束后,将样品池和接受池中的剩余液体倒掉,用磷酸缓冲溶液(pH=7.4)反复冲洗皮肤内外两面,并用滤纸轻轻拭干角质层面,在接受池中注入5ml 接受液,将样品池放回接受池中,取样方法、测定方法、计算方法与透皮实验相同。
结果
1.在行为学实验中发现,三种瘙痒模型(组胺致瘙痒模型、4-AP致瘙痒模型、复合因素致瘙痒模型)中,4-AP致瘙痒模型组与复合因素致瘙痒模型组与空白对照组相比,30min内搔抓次数均增多,差异具统计学意义(p<0.05,p<0.01);其中复合因素致瘙痒模型组的30min内搔抓次数要多于组胺致瘙痒模型组以及4-AP致瘙痒模型组,差异具统计学意义(p<0.01,p<0.05);复合因素致瘙痒模型组的搔抓潜伏期小于组胺致瘙痒模型组,差异具统计学意义(p<0.05)。血清ELISA检测显示组胺致瘙痒模型组的小鼠血清组胺浓度高于空白对照组(p<0.05);复合因素致瘙痒模型组的小鼠血清IFN-γ浓度高于空白对照组(p<0.05)。病理学检查显示与空白对照组相比,组胺致瘙痒模型组、4-AP致瘙痒模型组及复合因素致瘙痒模型组均出现炎细胞的增生、浸润,其中复合因素致瘙痒模型的反应更为明显。渗出的炎细胞以中性粒细胞为主。
2.薄荷醇高剂量组和阳性药组的30min内搔抓次数均少于空白模型组,且有非常显著的统计学意义(p<0.01);阳性药组的搔抓潜伏期高于空白模型组,且具有统计学意义(p<0.05)。血清ELISA检测未检测到有统计学意义的实验数据。病理检查显示模型对照组出现大量炎细胞的增生、浸润,3个薄荷醇治疗组(低、中、高剂量组)和阳性药组也可观测到少量炎细胞,但均少于模型对照组。渗出的炎细胞以中性粒细胞为主。
3.与模型对照组相比,马来酸氯苯那敏组、薄荷醇+马来酸氯苯那敏组、醋酸曲安奈德组及薄荷醇+醋酸曲安奈德组小鼠的30min内搔抓次数均有所减少(p<0.05,p<0.01);薄荷醇+醋酸曲安奈德组的小鼠搔抓潜伏期有所延长(p<0.05)。与马来酸氯苯那敏组相比,薄荷醇+马来酸氯苯那敏组小鼠的30min内搔抓次数显著减少(p<0.05)。与醋酸曲安奈德组相比,薄荷醇+醋酸曲安奈德组小鼠的30min内搔抓次数显著减少,搔抓潜伏期显著延长,差异均具统计学意义(p<0.05)。血清ELISA结果显示薄荷醇+醋酸曲安奈德组与醋酸曲安奈德组相比,小鼠血清IL-6浓度有显著升高(p<0.05),其余各组的3种细胞因子浓度(组胺、IFN-γ和IL-6)未检测到有显著差异。病理切片的结果显示模型对照组有大量炎细胞渗出,以中性粒细胞为主。其余各组与模型对照组相比炎症反应均相对较轻。薄荷醇+马来酸氯苯那敏组与马来酸氯苯那敏组相比,前者的炎细胞明显少于后者。薄荷醇+马来酸氯苯那敏组的抗炎效果优于马来酸氯苯那敏组。同样薄荷醇+醋酸醋酸曲安奈德组的抗炎效果亦优于醋酸醋酸曲安奈德组。
4.透皮实验结果显示:与空白模型组相比较,阳性对照组、中剂量及高剂量薄荷醇组的渗透速率P均高于空白模型组(p<0.01),但3组间未发现差异具统计学意义(p>0.05)。阳性对照组、中剂量及高剂量薄荷醇组3组的滞后时间T<,lag>显著低于空白模型组(p<0.05,p<0.01),3组间未发现差异具统计学意义。贮库效应实验结果显示:与空白模型组相比,阳性对照组的渗透速率P升高(p<0.05),差异具统计学意义;高浓度薄荷醇组的渗透速率P显著降低(p<0.05);各组间滞后时间T<,lag>则未发现有显著差异(p>0.05)。
结论
1.复合因素致瘙痒模型与空白对照以及单一因素致瘙痒模型相比,所致动物搔抓反应频率更高,潜伏期更短,该方法能够更有效地引起小鼠皮肤的急性炎症反应。组胺致瘙痒法能够升高小鼠血清组胺浓度,复合因素致瘙痒模型则能够升高小鼠血清IFN-γ浓度。
2.薄荷醇(4%)能够抑制由组胺和4-AP共同引起的小鼠瘙痒,使小鼠的搔抓次数减少,瘙痒潜伏期延长,局部组织的炎症反应减轻。对瘙痒小鼠血清中组胺、IFN-γ和IL-6无显著影响。
3.在治疗组胺和4-AP共同引起的小鼠瘙痒中,薄荷醇(4%)与马来酸氯苯那敏联用的止痒效果优于马来酸氯苯那敏单用,可使小鼠搔抓次数减少,局部组织的炎症反应减轻;薄荷醇(4%)与醋酸曲安奈德联用的止痒效果优于醋酸曲安奈德单用,可使小鼠搔抓次数减少,搔抓潜伏期延长,局部组织的炎症反应减轻,并使血清IL-6浓度显著升高。
4.薄荷醇(2%,4%)在体外能够促进马来酸氯苯那敏经小鼠皮肤的吸收,使其渗透速率增大,滞后时间缩短;其中薄荷醇(4%)的促透作用与其能减弱马来酸氯苯那敏的贮库效应有关。