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研究背景和目的细胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4,CYP3A4）是肝脏最重要的CYPs亚型,50%以上的临床药物经其代谢。由于CYP3A4高达几十倍的个体差异,导致临床上严重的药物不良反应和药物相互作用。CYP3A4差异表达受遗传和环境因素双重影响,既往研究聚焦于基因多态性对CYP3A4的影响,由于其分布频率低且有种族差异的特征,并不能完全解释和预测CYP3A4个体差异。长非编码RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）作为表观遗传调控的重要组成部分,在基因表达调控中发挥关键作用。已有研究报道,lnc RNAs在细胞核内可作为辅激活因子与转录因子发生相互作用而调控靶基因表达。课题组前期研究发现,在人肝脏组织标本中lnc RNA HNF1A-AS1与转录因子及主要CYPs的表达呈正相关,通过肝细胞实验发现HNF1A-AS1正向调控CYP3A4的表达。提示HNF1A-AS1可能与转录因子共同调控CYP3A4的表达,但具体调控机制尚不清楚。为探讨lncRNA HNF1A-AS1调控CYP3A4表达的分子机制,本研究拟:（1）HNF1A-AS1在调控Huh7和Hep G2细胞转录因子及CYPs表达中的作用;（2）HNF1A-AS1调控CYP3A4表达的分子机制。该研究为建立预测和评价CYP3A4个体差异及药物效应的分子标志物提供了新思路,也为指导临床合理用药提供新方向。实验方法一、探究HNF1A-AS1调控肝细胞HNF1A-AS1、转录因子及CYPs表达的作用采用HNF1A-AS1、HNF1A和PXR功能缺失和获得实验,通过RT-q PCR和Western Blot方法检测HNF1A-AS1、转录因子及CYPs基础及利福平（rifampicin,Rif,10μM）诱导表达水平。二、探究HNF1A-AS1调控肝细胞中CYP3A4表达的分子机制1.RNA原位杂交（RNAscope）和细胞核质分离实验明确HNF1A-AS1亚细胞定位制备爬片,通过RNAscope实验,采用激光共聚焦显微镜观察HNF1A-AS1定位情况。采用细胞核质分离实验,通过RT-q PCR和Western Blot方法检测HNF1A-AS1定位。2.RNA pull down-质谱和RNA免疫共沉淀（RIP）检测HNF1A-AS1结合蛋白将生物素标记的RNA探针与Streptavidin磁珠及全细胞裂解液共孵育,形成HNF1A-AS1-磁珠-蛋白复合物,质谱检测以筛选HNF1A-AS1结合蛋白。将细胞裂解液与靶蛋白特异性抗体及A/G beads共孵育,形成蛋白-beads-HNF1AAS1复合物,RT-q PCR检测HNF1A-AS1富集水平。3.采用免疫荧光（IF）、RNA原位杂交（RNAscope）和细胞核质分离实验明确HNF1A-AS1和PRMT1细胞定位制备爬片,按照RNAscope和免疫荧光步骤进行HNF1A-AS1和RNA结合蛋白精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）定位,采用激光共聚焦显微镜观察PXR和PRMT1共定位情况,及HNF1A-AS1对PRMT1亚细胞定位的影响。采用细胞核质分离实验,通过RT-q PCR和Western Blot方法检测HNF1A-AS1及PRMT1的定位。4.免疫共沉淀（Co-IP）测定蛋白质相互作用通过使用PXR/PRMT1及HNF1A/三基序蛋白25（TRIM25:HNF1A相关E3泛素连接酶）特异性抗体进行Co-IP实验,Western Blot分析蛋白质相互作用。采用HNF1A-AS1过表达或敲减后进行Co-IP实验检测蛋白之间的结合。5.染色质免疫共沉淀（Ch IP）分析HNF1A-AS1对CYP3A4启动子区组蛋白修饰水平的影响细胞转染48 h后进行交联,DNA片段经超声破碎、免疫沉淀及纯化DNA后,通过Ch IP-q PCR检测HNF1A-AS1对CYP3A4基因的启动子区域PXR结合位点（PXRE）H3K4三甲基化（H3K4me3）、H4R3二甲基化（H4R3me2）、H3K27三甲基化（H3K27me3）和H4乙酰化（H4ace）水平及PXR结合的影响。6.测定HNF1A-AS1对HNF1A蛋白稳定性及泛素化水平的影响通过放线菌酮（CHX）和蛋白酶体抑制（MG132）实验,Western Blot检测HNF1A蛋白表达变化,Co-IP分析HNF1A泛素化水平;以明确HNF1A-AS1是否通过蛋白酶体途径影响HNF1A降解,探究HNF1A-AS1调控HNF1A泛素降解的分子机制。实验结果一、HNF1A-AS1参与调控肝细胞CYPs及相关转录因子的表达1.HNF1A-AS1参与调控CYPs及相关转录因子的表达与对照组相比,敲低HNF1A-AS1可引起PXR和多数CYPs（CYP1A2除外）m RNA基础表达下调（P＜0.05）,同时降低Rif诱导的多数CYPs表达上调（P＜0.05）,且HNF1A、PXR与CYP3A4蛋白表达也明显降低（P＜0.05）;过表达HNF1A-AS1后,PXR、CYP1A2和CYP2E1基础表达上调（P＜0.05）,CYP1A2诱导表达增加（P＜0.05）,其他CYPs基础及诱导表达均不变。结果提示,HNF1AAS1的内源表达是调控PXR及多数CYPs所必须的。2.HNF1A参与调控HNF1A-AS1、CYPs和转录因子的表达敲低HNF1A可引起HNF1A-AS1表达下调（P＜0.05）,除Ah R外,转录因子表达均下降（P＜0.05）;除CYP1A2表达升高外（P＜0.05）,多数CYPs基础及诱导表达下调（P＜0.05）。过表达HNF1A,HNF1A-AS1表达上调（P＜0.05）,多数CYPs基础及诱导表达上调（P＜0.05）。结果提示HNF1A调控HNF1A-AS1、转录因子和CYPs的基础及诱导表达。3.PXR位于HNF1A-AS1/HNF1A下游且调控CYP3A4的表达敲低PXR,CYP3A4 m RNA和蛋白表达均下调（P＜0.05）,而HNF1A与HNF1A-AS1表达均不变;过表达PXR,CYP3A4 m RNA和蛋白表达均上调（P＜0.05）,但不影响HNF1A表达。结果提示PXR位于HNF1A-AS1/HNF1A下游参与调控CYP3A4的表达。二、HNF1A-AS1调控肝细胞中CYP3A4表达的分子机制1.HNF1A-AS1与PRMT1结合并影响PRMT1亚细胞定位RNAscope和核质分离实验显示HNF1A-AS1主要定位于细胞核;RNA pull down及RIP实验发现HNF1A-AS1与PRMT1相结合;RNA-蛋白双重定位发现HNF1A-AS1与PRMT1共定位于细胞核内,且过表达HNF1A-AS1促进PRMT1向细胞核富集。结果表明HNF1A-AS1结合PRMT1并影响其亚细胞定位。2.HNF1A-AS1介导PRMT1/PXR通路对CYP3A4的转录调控Huh7细胞中,敲低PRMT1,PXR与CYP3A4 m RNA和蛋白表达均下调（P＜0.05）;Ch IP-q PCR分析发现PRMT1敲低,CYP3A4启动子区PXR结合及组蛋白修饰H3K4me3、H4R3me2和H4ace的富集降低（P＜0.05）,而H3K27me3水平升高（P＜0.05）;Rescue实验表明PRMT1能够逆转HNF1A-AS1过表达导致的CYP3A4表达上调（P＜0.05）;PRMT1敲低逆转HNF1A-AS1过表达导致的CYP3A4启动子区H4R3me2、H3K4me3和H4ace水平升高（P＜0.05）。Co-IP和免疫荧光实验发现PRMT1与PXR相互作用,且HNF1A-AS1促进PRMT1与PXR结合。结果提示,HNF1A-AS1介导PRMT1影响CYP3A4启动子区PXR结合及组蛋白修饰状态。3.HNF1A-AS1通过抑制HNF1A泛素化而稳定其蛋白HNF1A-AS1敲低和过表达不影响HNF1A mRNA水平,但影响HNF1A蛋白表达;RNA pull down及RIP实验显示HNF1A-AS1与HNF1A结合;CHX实验证实HNF1A-AS1影响HNF1A蛋白降解;Western Blot实验显示HNF1A-AS1通过蛋白酶体降解途径影响HNF1A蛋白稳定性;免疫共沉淀证明HNF1A-AS1抑制HNF1A蛋白泛素化;HNF1A-AS1不影响TRIM25表达,但敲低TRIM25后HNF1A蛋白水平上调,且敲低TRIM25影响HNF1A泛素化水平;Co-IP表明HNF1A-AS1抑制Huh7细胞HNF1A和TRIM25的结合。结果提示,HNF1AAS1通过阻断蛋白酶体降解来稳定HNF1A蛋白。结论1.HNF1A-AS1/HNF1A/PXR通路介导肝细胞中CYPs的基础和诱导表达。2.HNF1A-AS1促进PRMT1和PXR相互作用并通过影响组蛋白修饰实现PXR的反式激活和CYP3A4转录调控。3.HNF1A-AS1抑制HNF1A与TRIM25的相互作用,阻止HNF1A泛素化和蛋白质降解,进而调控CYP3A4的表达。