论文部分内容阅读
第一部分改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型目的:采取改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,观察假手术组、脊髓损伤组在脊髓损伤后BBB评分及组织学区别。方法:建立大鼠胸10挫伤型脊髓损伤模型,对脊髓损伤后后肢运动功能变化采取BBB评分法评价,HE染色对各组脊髓损伤后的组织学变化进行观察。结果:大鼠胸10脊髓挫伤后,脊髓损伤组出现大片出血及坏死、细胞明显肿胀等;假手术组神经细胞呈现匀称分布、形状正常、细胞间质匀称,神经纤维排列较整齐。脊髓损伤组与假手术组BBB评分差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.成功建立大鼠胸10挫伤型脊髓损伤模型;2.BBB评分假手术组明显高于脊髓损伤组。第二部分PTEN/Akt/mTOR信号通路相关蛋白在大鼠脊髄损伤后的表达目的:阐明大鼠脊髓损伤后PTEN/AKT/mTOR信号通路相关蛋白PTEN、p-AKT、p-S6的表达、时间分布和其在脊髓损伤中的作用。方法:72只成年大鼠,SPF级,体重为200±20 g,损伤组采取改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,假手术组只做椎板切除,各组造模后2W、4W、6W、8W取材,Western blot法检测脊髓组织中PTEN/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:与假手术组对比,脊髓损伤组PTEN的表达水平在脊髓损伤后2W、4W、6W、8W下降明显;而p-AKT、p-S6的表达水平在相应时间点明显上升。结论:PTEN/AKT/mTOR信号通路中极其重要的调节位点PTEN在大鼠脊髓受损后明显减少,下游分子p-AKT、p-S6明显增加;提示该信号通路在大鼠脊髓损伤的产生、发展中可能起重要作用。把PTEN作为靶点,采用miRNA抑制PTEN可能对脊髓损伤有保护作用。第三部分体内慢病毒载体介导miR-29a过表达通过PTEN/AKT/mTOR通路促进大鼠脊髓损伤后轴突再生和功能恢复目的采取改良Allen’s法创立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,研究重组慢病毒载体LV-miR-29a在脊髓损伤修复中的作用及潜在机制。方法 取正常成年SD大鼠,建立胸T10挫伤型脊髓损伤模型,术中将重组慢病毒载体LV-miR-29a、空慢病毒载体LV-eGFP、生理盐水注射于脊髓损伤处头、尾侧,术后2W、4W、6W、8W进行BBB评分,并通过qRT-PCR检PTEN、NF-200,Western blot 检测 PTEN/AKT/mTOR 信号通路中相关蛋白 PTEN、AKT、p-AKT、S6、p-S6及NF-200表达,同时免疫荧光染色对神经纤维及突触素再生情况观测。结果与LV-eGFP组及生理盐水组相比,在术后2、4、6和8周LV-miR-29a组PTEN mRNA 的表达分别下降了 79±4.0%、85±3.0%、75±3.0%及 65±2.0%(P<0.001);Western blot 显示 PTEN 的表达下调了 77±3.0%、67±5.5%、67±2.0%、60±2.5%(P<0.001);而 p-AKT、p-S6水平均高于 LV-eGFP 组和生理盐水组(P<0.001);NF-200 的mRNA和蛋白显著增加(P<0.001);而LV-eGFP组与生理盐水组无显著差异(P>0.05)。免疫荧光结果显示在术后8W LV-miR-29a组NF-200和突触素分别是其它两组的4.0±0.2倍、2.9±0.1倍。BBB评分在术后2、4、6和8周LV-miR-29a较其它两组增加明显(P<0.001)结论过表达miR-29a明显抑制PTEN的表达,增强PTEN/AKT/mTOR信号通路,促进轴突再生和突触生成,促进脊髓损伤后功能的恢复