牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea,BVD）属于一种牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）所造成的急性、热性传染病。BVDV进入机体能够导致持续性感染以及免疫抑制的后果,且其持续对牛进行感染,会造成牛一直携带此病毒,同时还能够进行排出此种病毒,从而变为传染源,导致BVD的诊断以及防治存在较大的问题。随着近年来的发展,BVDV在我国的传播和感染范围逐渐扩大,特别是在大规模的养殖场,为我国的养牛业带来了较大的经济损失。为了防治BVDV在养殖场造成的感染,最基本的措施就是进行疫苗的注射。目的:本研究以致细胞病变型BVDV标准株NADL毒株为研究对象,借助分子生物学、细胞生物学、免疫学等手段,初步探索过氧化氢灭活牛病毒性腹泻病毒的条件,并且制备过氧化氢灭活疫苗,对接种疫苗的动物血清中BVDV特异性Ig G抗体消长规律、细胞因子含量变化及中和抗体效价的结果展开全面的分析,同时与甲醛灭活疫苗进行免疫效果比较,为该病的防控及灭活疫苗的研究提供理论依据。方法:首先将BVDV NADL毒株接种至MDBK细胞中,进行病毒的扩繁,经过超滤浓缩后提高毒株滴度并进行TCID50的测定。对过氧化氢溶液灭活BVDV NADL毒株的温度、时间及浓度的最优条件进行探究,并在细胞与分子水平上检验灭活病毒液的稳定性。根据灭活最优条件制备过氧化氢灭活牛病毒性腹泻病毒疫苗,经物理性状检验、无菌检验和安全检验后免疫昆明小鼠。在免疫后不同时间点,通过间接ELISA方法对小鼠血清中BVDV特异性Ig G抗体、细胞因子IFN-γ和IL-4含量进行测定,并通过中和抗体试验检测血清中针对BVDV的中和抗体水平,同时与甲醛灭活疫苗组、PBS对照组的免疫效果进行比较来完成对过氧化氢灭活疫苗免疫效果的评价。结果:通过培养MDBK细胞来对BVDV NADL毒株进行扩繁,多次回收病毒液后,于超滤管中通过高速离心进行浓缩,测定毒价为106.6TCID50/0.1 m L,提高了制备疫苗所需病毒液的抗原量,用于后续灭活病毒液条件的探究。通过对过氧化氢完全灭活BVDV NADL病毒液的浓度、时间及温度的最优条件的摸索,及细胞水平、分子水平上的验证的结果显示:牛病毒性腹泻病毒在27°C、2h的条件下被3%的过氧化氢完全灭活。过氧化氢灭活的BVDV NADL病毒液与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化后制成的疫苗经检验,其物理性状合格,安全。3组昆明小鼠分别被注射等量的PBS、过氧化氢灭活疫苗和甲醛灭活疫苗,间接ELISA方法对BVDV特异性Ig G抗体进行检测,过氧化氢灭活疫苗组特异性抗体水平显著高于甲醛组和PBS对照组。对免疫小鼠Th1型、Th2型细胞因子IFN-γ和IL-4的定量结果分析得到,过氧化氢灭活BVDV疫苗能够诱导一定水平的细胞免疫,但是与甲醛灭活疫苗组的免疫小鼠血清中相比差异不显著。中和抗体试验结果显示,过氧化氢组灭活疫苗在第42d的BVDV中和抗体效价可以达到1:25。结论:过氧化氢作为一种强力的氧化剂,可以快速灭活RNA和DNA病毒,并且对抗原结构或免疫原性的损害最小。本研究以BVDV NADL毒株制备了过氧化氢灭活疫苗,它能够刺激免疫小鼠产生高水平的BVDV特异性Ig G抗体,使机体产生针对牛病毒性腹泻病毒的中和抗体并诱发一定水平的细胞免疫反应,与传统的疫苗灭活方法如甲醛相比是非常有效的灭活方法。由此能够为我国BVDV灭活疫苗的研究开发以及疫苗候选株的筛选工作提供数据方面的支撑与具有实践价值的指导。