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目的:研究肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)重组MPN668蛋白是否具有降解有机氢过氧化物(Organic Hydroperoxide,OHP)的能力,并通过分子模拟解析rMPN668的结构,初步分析其结构与酶活性的关系,以进一步了解Mp的致病机制。方法:以Mp129株基因组DNA为模板,PCR法扩增目的基因mpn668,将其亚克隆至pGEX-6P-1载体中。经鉴定后将其转化至表达菌E.coli BL21中进行诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting等方法对表达产物进行分析鉴定并纯化GST融合蛋白;切除重组蛋白GST标签后,采用氧化铁二甲酚橙(Ferrous Oxidation-Xylenol Orange ,FOX)实验检测其氢过氧化物酶活性。固体培养Mp,随后将其置于氧化应激条件下培养3~5d,RT-PCR检测mpn668 mRNA的表达水平。利用同源建模和分子动力学等方法,通过软件Expasy与Visual Molecular Dynamics(VMD)模拟rMPN668的分子结构,并对其已预测出的酶活性位点的氨基酸进行定点突变,通过诱导表达获得△rMPN668突变蛋白, FOX实验测定其氢过氧化物酶活性。结果:成功扩增出总长度为423bp的mpn668基因,所构建的原核重组质粒经PCR、双酶切以及测序鉴定与预期目的基因相符。SDS-PAGE显示,IPTG可诱导一分子量约为41KD的可溶性GST融合蛋白,经GST?Bind? Purification Kit纯化后,纯度可达95%以上。FOX实验显示,经Prescission protease切除GST标签的rMPN668能降解有机氢过氧化物叔丁基过氧化氢( tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)以及无机H2O2,其降解能力与rMPN668浓度呈正相关;催化t-BHP时,20ng/μL rMPN668在2min内降解约500μM t-BHP,而催化H2O2反应时,催化效率远低于此水平,200ng/μL rMPN668降解500μM H2O2需要35min以上。RT-PCR分析表明,Mp在不同浓度的t-BHP(0.05M~1.00M)和氢过氧化枯烯(cumene hydroperoxide,CHP)(0.05M~1.00M)条件下,mpn668基因表达水平随着t-BHP和CHP浓度增大而升高;模拟的分子模型显示,rMPN668的二级结构序列为β1-β2-β3-α1-β4-β5-α2-α3-β6,Cys55可能位于其活性中心内。Cys55错义突变后,表达产物的酶活性几乎丧失。结论:(1) rMPN668具有氢过氧化物酶活性,能降解有机及无机氢过氧化物,但降解有机氢过氧化物的效率高于无机过氧化氢。(2)氧化应激条件下能上调Mp中mpn668基因的表达。(3) Cys55可能位于rMPN668的活性中心,在酶促反应中可能发挥关键作用。