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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是影响我国养鸭业最为严重的疾病病原之一,该病在养殖地区分布广泛,感染主要引起心包炎、肝周炎和气囊炎等,造成雏鸭生长缓慢、大批死亡严重制约着我国养鸭业发展。RA有21种血清型且不同血清型间交叉保护效果不好,目前市售疫苗存在一些缺陷如应用比较广泛的油乳剂灭活苗无法提供完全保护(70%左右的保护率)且存在注射吸收不理想,毒株覆盖不完全等问题。我们利用基因工程技术制备RA-CH1基因缺失活疫苗,旨在寻找一种能有效对RA进行有效减毒的疫苗株用于对该疾病的预防。本研究首先通过序列对比设计引物克隆了RA-CH1潜在的phoP基因。然后为了验证克隆基因的正确性,我们将扩增基因片段连接到低拷贝的pYA3337质粒上,再将重组质粒导入沙门氏菌ΔphoP基因缺失株中进行功能鉴定。结果表明,RA-CH1潜在的phoP基因能够回补沙门菌phoP基因的功能。同时,生物信息学预测结果显示克隆的phoP基因编码的PhoP蛋白没有信号肽位点和跨膜区。接着,我们对RA-CH1 phoP基因进行了原核表达及多克隆抗体制备,PCR扩增phoP基因连接至表达载体pET32a后转入Rosetta表达菌中。按照蛋白表达流程对其进行表达并优化表达条件,将表达蛋白进行纯化后免疫兔子制备多克隆抗体,琼扩试验测定多次免疫后兔子免疫抗血清效价比达到1：16,这为后续研究细菌中phoP调控网络及与蛋白间相互作用奠定了基础。我们还通过pRE112自杀质粒介导的同源重组构建RA-CH1ΔphoP基因缺失株,并对其生物学特性、免疫原性和免疫保护效应进行了系统性的研究。根据RA phoP上下游序列设计引物,通过交叠PCR融合phoP基因同源臂并在插入Spec抗性基因,构建重组质粒pRE112-Left-Spec-Right,通过细菌结合法将重组质粒导入RA-CH1中,用卡那霉素和壮观霉素双抗筛选得到RA-CH1ΔphoP基因缺失株,对RA-CH1ΔphoP进行生物学特性研究：生长曲线测定表明该突变株生长略慢于野生株；药敏试验表明缺失株对氨苄西林敏感性下降,对庆大霉素敏感性上升：测定缺失株对鸭胚成纤维粘附力与侵袭力能力发现与亲本株无明显差异；检测组织载量发现突变株接种后12h肝脏和24h大脑中组织载量显著低于野生株；另外,毒力试验发现基因缺失株毒力减近100倍。最后,我们评估了RA-CH1Δphop基因缺失株的免疫原性及免疫保护效果,将疫苗株经腿部肌肉注射接种雏鸭,三周后用约150×LDso剂量同源株攻毒并记录一个月内雏鸭的生长情况。通过ELISA检测了体液免疫反应,结果表明,一免后14、21天周免疫组的血清IgG抗体滴度水平明显高于对照组,表明该缺失株激发动物机体产生了高水平的体液免疫反应,攻毒后缺失株免疫组动物存活率为100%,且免疫组鸭子体重增长未受到显著影响。以上结果表明RA-CH1ΔphoP毒力减弱,具有较好的免疫原性并能产生一定的免疫保护效应。