甘蓝型油菜是世界第三大、中国最重要的油料作物。它的主要产物菜籽油不仅是上等的食用油,而且也是重要的工业原料,因而研究甘蓝型油菜种子含油量的调控机理具有重要的战略意义。甘蓝型油菜种子含油量是数量性状,符合主效基因+多个微效基因的遗传控制模式,而且等位位点具有累加效应。以前研究表明调控种子油合成途径中的关键酶能够改变含油量,但是最近研究发现种子含油量更倾向于被一种联合调控机制调控。这种联合调控机制不仅与油含量自身合成途径相关,而且也受诸如糖代谢这样的其他代谢途径的影响,因而在碳代谢水平上筛选与含油量相关的突变体进而克隆其主控基因成为研究含油量积累的一种新的途径。在甘蓝型油菜的近缘物种拟南芥中,已相继克隆了一系列与含油量相关的重要调控基因(例如,AtWRINKLED1和AtGLABRA2),研究发现它们都编码转录因子,在种子含油量积累过程中扮演重要角色。本文根据种子含油量的遗传特点,以甘蓝型油菜种子发育相关转录因子BnWRINKLED1 (BnWRI1)和GLABRA2(GL2)为出发点,首先利用多种基因功能研究方法(过表达、反义抑制、RNAi)研究了这两个转录因子与种子含油量的关系,然后利用最新反向遗传学方法TILLING技术从新构建的甘蓝型油菜EMS突变体库中筛选了甘蓝型油菜两个GL2基因的等位位点突变体,试图通过聚合高含油量等位位点提高种子含油量。本文的研究结果为进一步阐明油含量的调控机理和培育新品种奠定了基础。其主要研究结果包括:1.甘蓝型油菜BnWRI1基因的功能验证为了探讨甘蓝型油菜BnWRI1基因与种子含油量的关系,本文采用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384bp的片段,将其正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双九号中获得三棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交都证实了外源片段已整合在受体油菜基因组中。半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株BnWRI1基因的表达量和种子含油量,结果表明:与非转基因对照相比,三个转基因株株的BnWRI1基因都受到抑制,种子含油量都有所降低。我们的结果表明油菜BnWRI1基因能正调控调控种子含油量的积累。2.芸薹属四个GL2同源基因的克隆及其表达模式的分析为了探讨转录因子GL2基因与种子含油量的关系,本文根据拟南芥GL2基因序列,利用一种overlapping-PCR的方法从甘蓝型油菜(AC基因组)和它的两个近缘种白菜型油菜(A基因组)、甘蓝(C基因组)中分别克隆得到了四个同源的GL2基因。这四个基因有相似的核酸结构,包含9个外显子、8个内含子,都编码750个氨基酸,属于HD-ZIPⅣ亚家族。序列比对发现甘蓝型油菜BnaA.GL2.a与白菜型油菜BraA.GL2.a更为相似,而甘蓝型油菜BnaC.GL2.b与甘蓝BolC.GL2.a聚在一起。研究这四个GL2的表达模式表明来自于A基因组的两个GL2基因在根中强烈表达,而来自于C基因组的两个GL2基因在种子中表达较强。3.甘蓝型油菜BnaC.GL2.b基因的功能鉴定及功能标记的开发为了进一步探讨甘蓝型油菜BnaC.GL2.b基因对种子含油量的影响,我们分别构建了这个基因的过表达和反义抑制载体转化拟南芥。结果表明,抑制甘蓝型油菜BnaC.GL2.b基因不仅能负调控毛状体的发育,而且能显著促进种子含油量的积累。我们推测BnaC.GL2.b在甘蓝型油菜种子含油量调控过程中起重要作用。根据这四个GL2基因的序列特征,我们设计了三对A/C基因组特异的PCR引物,鉴定了一个C基因组特异的EcoRⅤ位点,通过这两类功能标记,芸薹属三个物种和四个GL2基因被有效地区分了开来。4.甘蓝型油菜EMS突变体库的构建及其正向遗传学评估创建突变体库是功能基因组学研究的重要手段。本文利用甘蓝型油菜双低高油品种“中双九号”为野生型亲本材料,通过0.5%的EMS诱变获得了一个包含9814个M2单株(3188个株系)的突变体库。然后,对这个突变体库M2代单株按照株型、花、叶、茎、角果等性状进行了全面调查统计,并重点分析了EMS诱变对M2种子含油量的影响。本文构建的甘蓝型油菜突变体库不仅积累了大量的优异种质资源,而且也为用TILLING技术研究基因功能奠定了基础。5.甘蓝型油菜TILLING技术平台的建立及甘蓝型油菜GL2基因等位位点的筛选为了鉴定甘蓝型油菜两个GL2基因的等位位点突变体,我们成功建立起了甘蓝型油菜TILLING技术平台。截止目前,我们已对其中的一个GL2(BnaA.GL2.b)基因在1632个M2单株中进行了筛选,得到了18个可能的突变单株,后续测序、遗传学分析等工作正在开展中,相信我们的结果能够为有效调控油菜种子含油量提供指导。