尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum J.H.Owen,FOC)引起的黄瓜枯萎病正严重影响着世界各地的黄瓜生产。本实验室在健康黄瓜根际筛选到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9能够有效抑制尖孢镰刀菌,并且能显著促进黄瓜植株的生长。根系分泌物在多种土壤生物过程中具有重要作用,同样在SQR9、FOC和黄瓜根系之间的相互作用中可能具有重要的调节和信号的作用。根系分泌物中的小分子有机物质可能介导根际的交流过程。本研究以病原菌FOC、根际有益菌SQR9与黄瓜三方互作为模型,深入并且高通量地分析了接种不同微生物对黄瓜根系分泌物的影响,进而通过相关性分析研究根系分泌物组分在三方相互作用中对定殖的影响,最后解释了影响定殖的部分信号分子机制。此外,通过研究SQR9与黄瓜之间的相互作用导致的根系分泌物的变化,发现了根系分泌物中色氨酸对于SQR9发挥根际促生的重要作用。主要研究成果如下:FOC的侵染导致了SQR9在黄瓜根际定殖的显著增加。通过研究茎基部接种FOC对黄瓜根系分泌物小分子有机酸的影响,发现柠檬酸和延胡索酸有显著提高,其中柠檬酸在20-50μM浓度下显著吸引SQR9,而延胡索酸在20-50μM浓度下显著促进SQR9的生物膜形成。同时,由于FOC对黄瓜的侵染导致SQR9的根际定殖的升高,确定柠檬酸和延胡索酸在黄瓜受侵染条件下对SQR9定殖的积极作用。在根际接种SQR9的同时添加色氨酸可以有效地增强SQR9的促生作用,说明色氨酸能够增强SQR9的根际促生效果。通过分根实验发现一侧接种SQR9导致黄瓜根系分泌物中色氨酸含量的提高4倍,并且在预接种的黄瓜根部的SQR9的IAA合成相关基因表达显著上调,其中参与吲哚乙腈途径的关键酶基因yhcX上调超过20倍,说明SQR9引起的黄瓜根系分泌物的改变促进了SQR9的IAA合成。在培养基中外源添加正常黄瓜的根系分泌物和接种SQR9的黄瓜的根系分泌物均显著加快了SQR9的生长,而且SQR9接种的黄瓜根系分泌物导致SQR9的IAA产量提高,而未接种的黄瓜根系分泌物没有显著影响SQR9的IAA产量。但在其中加入色氨酸至SQR9接种后的黄瓜的根系分泌物中色氨酸的含量同样促进了SQR9的IAA合成。实验表明,SQR9的促生效果并非单纯利用黄瓜根系分泌物,而是通过一系列相互识别导致了色氨酸的分泌而引发的互利的相互作用。接种删除了yhcX基因的突变体(△yhcX)仍具有显著促生效果,但是失去了对外源色氨酸的响应,猜测SQR9在根际仍利用其他不依赖于色氨酸的IAA合成途径以及不依赖于IAA的促生。邻氨基苯甲酸合成酶是黄瓜合成色氨酸的关键酶,黄瓜还具有特异性的色氨酸转运蛋白,通过与PlantGDB比对,该基因特异性存在于黄瓜中。通过定量PCR发现接种SQR9导致了黄瓜根部的色氨酸转运蛋白的表达上调,但是没有显著影响黄瓜的邻氨基苯甲酸合成酶,推测植物可能通过该蛋白主动向外泵出色氨酸。然而该转运蛋白的工作机理尚不清楚,仍需要进一步探究及确认。为了研究FOC、SQR9和黄瓜根系之间的三方互作,通过分根系统切断了FOC与SQR9之间的直接作用,进而研究FOC与SQR9之间依赖于根系分泌物的相互影响。利用平板计数的方法发现,SQR9和FOC的预接种均导致SQR9定殖的提高。接种FOC和SQR9导致再次接种的SQR9的生物膜形成相关基因受到显著影响,生物膜形成下游基因eps和正调控因子sinI均显著上调。通过荧光定量PCR的方法采用FOC特异性引物检测定量FOC的拷贝数,结果显示SQR9和FOC的根际接种均抑制了后续FOC的定殖。通过对SAR和ISR的诱导相关的植物内源物质的酶联免疫分析(ELISA)测定,发现FOC和SQR9的接种均引起根系内源茉莉酸的显著提高,SQR9的接种同时提高了根系水杨酸和茎部乙烯的含量,该变化可能参与SQR9和FOC接种后对后续FOC定殖的抑制。为了研究根系分泌物在上述定殖变化中的影响,在分根装置中收集了SQR9、FOC、J12、168接种后未接种一侧的根系分泌物,通过冷冻干燥浓缩至粉末,通过甲氧化和硅烷化衍生后使根系分泌物中的不易汽化的糖类和一些热不稳定物质转化为可以通过气相色谱分离的物质,然后利用气相色谱-质谱联用方法(GC-MS)高通量分析了根系分泌物中的小分子有机成分,并以质谱图与数据库比对,以峰高度代表相对含量,共鉴定到110种物质,其中包括8种酰胺、17种氨基酸、20种糖、7种糖酸、13种糖醇、9种脂肪酸、18种有机酸以及18种未分类的物质。主成分分析(PCA)显示四种接种处理与对照根系分泌物之间相互分离,重复性较好且相互之间差异显著。SQR9处理中相对于对照变化的物质最多,其中35种物质显著下调。以总峰高度与对照相比,SQR9处理的根系分泌物中酰胺类、氨基酸和未分类的物质显著升高,有机酸、脂肪酸和寡糖类物质明显减少。FOC接种处理的黄瓜根系分泌物中氨基酸和脂肪酸均有大幅增加,未分类的物质有显著减少。通过将所得的根系分泌物分类结果同各个处理相对应的SQR9和FOC的根际定殖结果进行Spearman秩相关分析,发现FOC定殖与酰胺和糖酸成显著负相关关系,对根际定殖与单个物质的相关性分析发现8种与SQR9或FOC定殖显著相关的物质,其中包括棉籽糖、阿拉伯糖醇与FOC定殖正相关,戊五醇、葡萄糖和莽草酸与FOC定殖负相关,色氨酸与SQR9定殖正相关,麦芽糖醇和山梨糖醇与SQR9定殖负相关。通过外源添加的方式观察8种相关物质对SQR9或FOC定殖的影响,发现FOC定殖随着外源棉籽糖和阿拉伯糖醇用量的增加而提高,同时随着戊五醇、葡萄糖或者莽草酸的升高而减少,变化趋势与相关性分析完全吻合,而SQR9定殖结果显示色氨酸显著提高了 SQR9的根际定殖,并且可以加快SQR9生物膜的形成,但是对SQR9没有趋化吸引作用。SQR9的定殖水平随麦芽糖醇和山梨糖醇的增加而增加,但与相关性分析不吻合。经过分析该8种物质在根系分泌物中的浓度范围,发现戊五醇、阿拉伯糖醇、莽草酸、麦芽糖醇在SQR9或FOC接种的黄瓜根系分泌物中的浓度变化范围很小(不超过1倍),可能不会对定殖产生主导影响,而葡萄糖和山梨糖醇的浓度与定殖结果相悖,他们在实际定殖中的作用被冲淡或者没有作用。最终结果显示,棉籽糖参与FOC的定殖,当黄瓜识别到根际环境中的SQR9或者FOC时,降低了棉籽糖的分泌,以此控制FOC的进一步定殖和侵染。同时提高了色氨酸的分泌,以吸引SQR9协助黄瓜生长和抵抗胁迫。论文研究了根际互作对黄瓜根系分泌物的影响,并阐述了其中色氨酸对SQR9的根际促生的作用机理,并且研究了土传病原菌和SQR9的根际定殖中的信号分子及互作机理。