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组织工程研究中利用载体或缓释系统负载生长因子,既能保护生长因子的生物活性,又可以使生长因子缓慢释放,从而持续促进相关细胞生长及组织修复再生,是目前控制释放支架材料应用研究的方向之一。清华大学材料系研制的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite／collagen,nHAC)具有与天然松质骨类似的三维孔洞网络结构,已做为一种较好支架材料用于组织工程研究；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种具有特异性促进血管内皮生长和血管生成的诱导因子,可以明显促进成骨细胞的增殖,在骨损伤修复中具有重要作用。本实验利用生物学方法将VEGF负载于n HAC上,观察该复合支架中VEGF的缓释效果的和对成骨诱导的入骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)黏附及增殖的影响,了解二者生物相容性,旨在通过体外实验为骨组织工程寻求一种新型复合支架材料.
第一部分纳米晶胶原基骨／血管内皮生长因子缓释支架的实验研究
材料和方法:nHAC用无水酒精浸泡预处理后,再经不同基质表面修饰后加入VEGF,制备缓释支架。实验分为四组:实验组A:nHAC、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、肝素(heparin,HP)和VEGF(nHAC-FN-HP-VEGF)；对照组B:nHAC、FN和VEGF(nHAC-FN-VEGF)；对照组C,n HAC、HP和VEGF(nHAC-HP-VEGF)；对照组D:nHAC和VEGF(nHAC-VEGF)。将VEGF配制成浓度为0.1mg／ml溶液,等量滴加于支架材料上制备缓释系统。体外用磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsolution,PBS)浸泡支架,应用酶联免疫吸附剂测定方法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测各实验组相同时间点缓释液内的VEGF含量,绘制释放曲线,确定释放时间,比较分析各种缓释系统缓释效果的差异。
结果:实验组A的VEGF缓释量最高,持续时间最长(可达14d),与其他各组相比有显著性差异；
结论:肝素和纤维连接蛋白修饰后的nHAC与VEGF构建的nHAC-FN-HP-VEGF缓释支架具有更长、更稳定的释放能力。
第二部分纳米晶胶原基骨／血管内皮生长因子缓释支架对人骨髓间充质干细胞体外粘附增殖的影响
材料和方法:取健康成年男性骨髓,密度梯度离心法分离有核细胞层,得均一性较好的hMSCs,传代培养至第三代后经成骨诱导培养、扩增,并进行成骨细胞表型鉴定后,种植于四种缓释支架材料体外复合培养,实验分为四组:实验组A:结合有纤维连接蛋白(FN)、肝素(HP)和VEGF的纳米晶胶原基骨复合支架(nHAC-FN-HP-VEGF)；对照组B:结合有纤维连接蛋白及VEGF的纳米晶胶原基骨复合支架(nHAC-FN-VEGF)；对照组C:结合有肝素和VEGF的纳米晶胶原基骨复合支架(nHAC-HP-VEGF)；对照组D:结合有VEGF的纳米晶胶原基骨支架(nHAC-VEGF)。通过检测缓释支架材料上种植细胞后细胞的黏附率、不同时间点(3、7、10、14d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及扫描电镜观察细胞在材料上的生长状况,比较分析不同缓释支架材料与细胞生物相容性差异。
结果:第三代hMSCs经诱导培养14d后,碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色均为阳性；实验组A的细胞黏附率最高,为61.8％；各组支架中的细胞数量均随培养时间延长而增长,实验组A的细胞数增加较快,与相同时间点其他各组材料中细胞数差异有显著性(P<0.05)；各时间点细胞碱性磷酸酶活性表达实验组A最高,差异亦有显著性(P<0.05)。电镜扫描发现4组材料上细胞生长良好,但以实验组A的细胞增殖、分化状况明显好于其他组。
结论:hMSCs经诱导培养后可具有成骨细胞特性,nHAC-FN-HP-VEGF缓释支架与hMSCs具有较好生物相容性,能显著提高细胞的粘附和增殖,可作为较理想的新型复合支架应用于骨组织工程。