论文部分内容阅读
水稻是世界大多数人口的主要粮食作物,其产量对于粮食安全和减少贫困具有重要意义。褐飞虱是对水稻危害最为严重的害虫之一,它通过口针刺穿水稻组织吸食初皮部营养物质而对水稻植株造成危害。在大田生产中,褐飞風持续取食会消耗光合作用产物从而阻碍水稻生长,引起植株蒌蔫,造成减产甚至颗粒无收,这种现象被称为"飞風火烧”。种植抗性水稻来防御害虫是一个资源节约型、环境友好型的举措。深入研究和理解水稻的抗性机制对通过分子设计培育抗虫水稻品种具有重要实践意义。植物是固着生物,不断遭受着外界环境中细菌、真菌和昆虫等入侵者的危害。因此,植物通过受体蛋白识别病程/取食相关分子模式（Pathogen/Herbivory-associated molecular patterns,PAMPs/HAMPs）而触发免疫反应（PAMPs/HAMPs-triggered immunity,PTI/HTI）来应对这些入侵者的危害,该免疫反应在植物基础抗性中发挥着关键作用。几丁质就是许多病原菌的PAMPs分子,细胞膜的表面受体蛋白OsCEBiP是几丁质激发子结合蛋白,它通过胞外2个LysM基序识别几丁质,从而介导了植物对病原菌的PTI免疫反应。我们之前在抗虫和感虫水稻軔皮部汁液蛋白质组中鉴定出了OsCEBiP蛋白,它是受褐飞風取食诱导上调表达的,推测OsCEBiP是初皮部特异表达的蛋白并参与了水稻对褐飞虱的防御反应。首先,我们克隆了基因的启动子,构建了6个全长和截短启动子载体转化水稻合江19,分别获得了独立的单拷贝纯合转基因植株。通过检测报告基因的表达来比较分析了这些启动子的时空特异性。结果表明C0.6,C0.9,C1.3,C1.8启动子都能驱动报告基因在维管束韧皮部细胞中表达,C0.2的表达量最强,随着启动子长度越长,其表达强度逐渐减弱。同时我们也分析出了一些可能与组织特异表达相关的顺式作用元件。然后,为了研究基因是否参与了对褐飞風的防御反应以及它的抗虫功能,我们获得了两个OsCEBiP突变体株系,oscebip-1是基因敲除植株,oscebip-2是过表达植株。同时也利用农杆菌介导的遗传转化方法获得了超量表达和RNAi抑制转基因植株。褐飞虱在oscebip-1上取食后的蜜露量是显著多于在oscebip-2上取食后的蜜露量。宿主选择性实验也表明与oscebip-2相比,褐飞虱更倾向于聚集在oscebip-1植株上。这些实验表明OsCEBiP基因敲除的水稻增加了对褐飞虱敏感性。进一步研究表明褐飞風取食能引起植株胼胝质沉积,抗性相关基因的上调表达,而该类反应在oscebip-】株系中受到了明显抑制。这些结果表明0?(?^:历尸除了介导植物对病原菌的防御反应外（PTI）也参与了对植食性昆虫的防御反应（HTI）。为了分离出OsCEBiP所识别的来源于褐飞風的分子,我们把褐飞虱虫体研磨成粉末,分成了可溶性上清组分和不可溶沉淀组分。在本文中,我们发现褐飞虱虫体沉淀组分同几丁质一样能诱导oscebip-2和野生型植株中活性氧爆发,胼胝质沉积和防御基因的表达,而这些反应在oscebip-1植株中受到了抑制,表明褐飞風虫体沉淀能诱导水稻的防御反应PTI/HTI,而且这些防御反应是依赖于OsCEBiP的。有研宄表明褐飞虱虫体沉淀的主要成分就是几丁质,本实验表明几丁质也能作为褐飞風的HAMPs而促发HTI。此外,我们还发现褐飞風虫体可溶性上清组分能抑制几丁质诱导的氧爆发。前人研究表明病原菌和昆虫能分泌效应子蛋白来抑制植物这层先天免疫反应。为了分离出褐飞虱其他可能的HAMPs分子和效应蛋白,我们通过酵母双杂交实验筛选了褐飞虱酵母文库。通过RACE扩增技术得到褐飞風基因全长后,进行“点对点”验证,目前得到了几个表皮蛋白、凝结蛋白、几个糖蛋白等,这些候选互作蛋白的功能还需要实验进一步验证。OsCEBiP是水稻初皮部特异表达的细胞表面受体蛋白,它能识别褐飞虱虫体沉淀组分,引起水稻的氧爆发,胼胝质沉积和防御基因的上调表达。而褐飞虱虫体可溶性上清却能抑制几丁质诱导的氧爆发。这些结果有利于我们加深理解asCfi■历P在植物免疫系统中的功能,有利于理解植物对刺吸式昆虫的防御反应的机制。蛋白酶抑制剂在保护植物以防御朝皮部取食昆虫方面具有很大的应用前景。大部分丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员都能可逆地抑制丝氨酸蛋白酶或半耽氨酸蛋白酶的活性。动物丝氨酸蛋白酶抑制剂在先天免疫,血液凝固和发育等方面发挥了一系列生物学功能。而在植物中它们的生物学功能尚不清楚。丝氨酸蛋白酶抑制剂参与到了各个生物学过程中,调控着蛋白降解级联反应,故推测其可能参与到水稻对褐飞虱的防御反应过程中。在本研究中,我们从抗性水稻中克隆了一个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(ChSerpin、。之前激光显微切割和RT-PCR分析了该基因在勒皮部细胞中特异表达,所以我们构建了5个全长和截短启动子载体转化水稻,分别获得了独立的单拷贝转基因株系。由于启动子活性低,在转基因植株中检测不到GUS报告基因的表达。基因在各个器官中都有表达,包括幼叶,成熟莲,成熟叶等。此外,褐飞虱取食后该基因表达上调4倍之多。然后我们对进行了超量表达RNAi抑制的转基因研究。宿主选择性实验表明与超量表达株系相比,褐飞虱更倾向于聚集在RNAi抑制株系上。褐飞風取食超量表达株系的蜜露量少于其取食野生型的蜜露量,而褐飞風取食RNAi抑制株系的蜜露量与取食野生型之间无显著性差异。最后,我们尝试研究OsSeipin的蛋白活性。这些结果表明基因在植物防御植食性昆虫方面发挥着重要作用,有利于我们培育出抗褐飞虱的优良水稻品种。