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目的:(1)构建人表皮生长因子受体(HER2/neu)胞外区基因的真核表达质粒(pcDNA6-HER2/neu);转染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),获得其稳定表达细胞株(EMT6/HER2/neu)。(2)构建HER2neu、IL12融合基因重组核酸疫苗pcDNA6-HER2/neu-IL12。(3)将该疫苗在HER2/neu阳性乳腺癌小鼠体内应用,探讨其预防和治疗作用。方法:(1)HER2/neu重组质粒的构建:用PCR从含HER2/neu全长基因的pcDNA3.1-HER2/neu质粒上扩增HER2/neu胞外区(ECD)基因片段;经酶切、连接构建pcDNA6-HER2/neu,通过酶切及测序鉴定;(2)建立HER2/neu阳性小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/HER2/neu):以PEI法将pcDNA6-HER2/neu导入小鼠乳腺癌细胞(EMT6)中,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得抗性克隆EMT6/HER2/neu;用RT-PCR检测EMT6/HER2/neu中HER2/neu mRNA,免疫组化法检测其HER2/neu蛋白的表达。(3)pcDNA6-HER2/neu-IL12的构建:用PCR方法从pcDNA6-IL12质粒上扩增IL12序列;同样进行酶切、连接、转化、筛选;将其插入pcDNA6-HER2/neu质粒中HER2/neu基因下游,获得pcDNA6-HER2/neu-IL12;对其进行酶切及测序鉴定。(4)pcDNA6-HER2/neu-IL12对HER2/neu阳性小鼠乳腺癌的防治作用:①预防组:选6-8周体重16-18g昆明种小鼠30只,随机分成5组。Ⅰ组:pcDNA6-HER2/neu组;Ⅱ组:pcDNA6-IL12组;Ⅲ组:pcDNA6-HER2/neu+pcDNA6-IL12组;Ⅳ组:pcDNA6-HER2/neu-IL12组;Ⅴ组:生理盐水组。各组小鼠每隔两周在其股四头肌注射相应质粒(1ug/ul)或生理盐水50ul,共免疫3次。于最后免疫两周后在小鼠右胸皮下接种EMT6/HER2/neu细胞(2×10~6个/ml,100ul/只),分别于第7、10、14、17、20、24天测量肿瘤大小,第24天处死小鼠,剥取瘤体、脾脏并称重;分离小鼠脾淋巴细胞,分别检测其特异性淋巴细胞增生反应(MTT法)、淋巴细胞杀伤活性(LDH释放法)和特异性IFN-γ释放(ELISA)等细胞免疫学指标。②治疗组:另选6-8周体重16-18g昆明种小鼠30只,分组方法同预防组(命名为A、B、C、D和E)。全部小鼠于右胸皮下接种EMT6/HER2/neu细胞(2×10~6个/ml,100ul/只)致瘤,分别于第7、10、14、17、20天给予瘤内注射相应质粒(1ug/ul)或生理盐水100ul,并测量肿瘤大小,第24天处死小鼠,检测的免疫学指标同预防组。结果:(1)HER2/neu PCR产物大小与预期一致(1896bp);pcDNA6-HER2/neu经酶切、琼脂糖凝胶电泳后,可见与PCR产物大小相同的片段;DNA测序结果显示,pcDNA6-HER2/neu中HER2/neu基因序列无误,读框正确。(2)用RT-PCR可在EMT6/HER2/neu中检测到HER2/neu mRNA;经免疫组化染色证实,EMT6/HER2/neu中有HER2/neu的阳性信号。(3)对pcDNA6-HER2/neu-IL12融合基因重组质粒的酶切及测序结果表明,HER2/neu和IL12两段基因序列无误,连接方向及读框正确。(4)动物实验结果显示,单独应用HER2/neu和IL12基因疫苗或二者联合应用对HER2/neu阳性乳腺癌(预防组Ⅰ-Ⅳ;治疗组A-D)均获得显著的预防和治疗作用;而应用pcDNA6-HER2/neu-IL12表现更为强大的抗肿瘤作用;多项免疫学指标检测结果显示,pcDNA6-HER2/neu-IL12可显著提高实验小鼠特异性抗肿瘤细胞免疫力。pcDNA6-HER2/neu-IL-12的抗肿瘤效应与pcDNA6-HER2/neu和pcDNA6-IL12联合应用组相当。该融合基因疫苗比两种重组质粒联合应用具有易制备、使用简单、成本低廉等优点。结论:本研究成功地构建了HER2/neu胞外区真核表达质粒(pcDNA6-HER2/neu)和HER2/neu-IL12融合基因疫苗(pcDNA6-HER2/neu-IL12);获得了稳定表达HER/neu基因的小鼠乳腺癌细胞株(EMT6/HER2/neu);pcDNA6-HER2/neu-IL12对HER2/neu阳性乳腺癌具有理想的预防和治疗作用。