背景主要组织相容性复合物(major histocompability complex, MHC)是位于哺乳动物某一染色体上的一组紧密连锁的基因群,其产物是参与抗原递呈和T细胞激活的关键分子,在免疫应答和免疫调节中执行重要而广泛的功能。其中MHC-Ⅰ基因编码的Ⅰ类分子主要参与排斥反应、抗体产生、细胞裂解和向CD8阳性T细胞提呈抗原。在肿瘤免疫研究领域,人们往往把目光集中在肿瘤细胞表面的MHC-Ⅰ分子上,肿瘤组织MHC-Ⅰ分子表达降低或缺失,循环中的CTL细胞表面不能有效识别肿瘤抗原,癌组织中浸润淋巴细胞功能下降。但作为体内表达MHC-Ⅰ类分子最丰富的细胞,淋巴细胞尤其是T淋巴细胞MHC-Ⅰ类分子的功能研究却较少见。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,机体免疫功能与乳腺癌的发生、发展有密切的关系。机体免疫功能低下是肿瘤发生、发展的条件,而肿瘤恶性生长、增量的结果又加深了对免疫系统的抑制作用。而抗肿瘤免疫效应以细胞免疫为主,而T淋巴细胞是最主要的效应细胞,但在肿瘤患者体内却往往不能有效发挥其抗肿瘤效应。已有研究者发现,外周血淋巴细胞表面HLA—A、BmRNA表达随年龄老化而降低,可以作为机体免疫功能衰退的指标；MHC-Ⅰ类分子对记忆T细胞具有保护作用；CD4阳性T细胞表面MHC-Ⅰ类分子可以延长CD4阳性T细胞的存活时间。我们推测,与肿瘤细胞表面的MHC不同,在免疫中起重要作用的T淋巴细胞表面表达的丰富的MHC-Ⅰ可能影响着T细胞功能,在抗肿瘤免疫过程中占有极其重要的地位。健康人外周血淋巴细胞表面表达着丰富的MHC-Ⅰ分子。那么在肿瘤发生发展时,外周血淋巴细胞尤其是T淋巴细胞MHC-Ⅰ分子发生了怎样的变化?对T淋巴细胞尤其是CTL细胞的功能又产生着怎样的影响呢?这成了肿瘤免疫领域亟待解释的问题。目的1、检测乳腺癌患者外周血淋巴细胞及其亚群MHC-ⅠmRNA和蛋白水平的表达变化,与肿瘤进展积分期的关系,及临床治疗对它的影响。构建荷乳腺癌小鼠模型,进一步观测外周血淋巴细胞及肿瘤浸润淋巴细胞MHC-Ⅰ基因表达的动态变化规律。探讨淋巴细胞MHC-Ⅰ在评估肿瘤患者细胞免疫状态中的价值。2、通过RNAi技术从基因水平抑制CTL细胞MHC-Ⅰ基因表达,利用单克隆抗体封闭CTL细胞膜表面的MHC-Ⅰ蛋白,研究CTL细胞的功能变化。从而探讨CTL细胞表面的MHC-Ⅰ分子对CTL细胞功能的影响。3、构建小鼠荷瘤+皮肤移植模型,诱导高强度的移植排斥反应,研究移植排斥反应时外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达规律,探讨外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ变化对肿瘤体内生长的影响。方法1、通过实时荧光定量PCR检测乳腺癌患者外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ不同位点HLA-Ⅰ、HLA-A、HLA-B mRNA的不同表达变化,利用流式细胞技术检测乳腺癌患者外周血淋巴细胞不同细胞亚群,CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)表面MHC-Ⅰ蛋的不同变化规律。分析外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ与乳腺癌分期和进展的关系。并进一步随访手术和化疗的乳腺癌患者,研究手术和化疗对外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达的影响。2、小鼠接种4T1乳腺癌细胞,构建小鼠荷乳腺癌模型,动态观察肿瘤进展不同时间外周血淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞MHC-Ⅰ的变化规律,分析两者间的相互关系。3、利用针对小鼠MHC-Ⅰ基因的siRNA,抑制细胞毒性T淋巴细胞系CTLL-2 MHC-Ⅰ基因的表达,进一步检测CTLL-2功能变化；通过抗小鼠MHC-Ⅰ单克隆抗体封闭DC细胞诱导的4T1抗原特异性CTL细胞表面MHC-Ⅰ分子,观测对CTL细胞功能的影响。从而研究CTL细胞MHC-Ⅰ的功能。4、构建小鼠皮肤移植模型,诱导急性移植排斥反应的发生,观察外周血MHC-Ⅰ的变化规律。结合小鼠4T1乳腺癌接种后肿瘤生长曲线,确定皮肤移植和肿瘤接种的最佳时间；构建小鼠移植+肿瘤模型,观察同时接受异系皮肤移植诱导排斥反应和接种肿瘤两种干预手段条件下,小鼠肿瘤生长情况和皮肤移植排斥情况的改变,研究排斥反应对肿瘤体内生长的影响。结果1、实时定量荧光RT-PCR检测外周血淋巴细胞HLA-L、HLA-A、HLA-B mRNA表达。外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA表达水平与年龄无关。HLA-A和HLA-ⅠmRNA在乳腺良性肿瘤、癌前病变和进展早期的Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者中,表达水平与健康人没有显著性差异,在进展晚期的Ⅲ、Ⅳ期患者中表达降低。HLA-B mRNA不同,在乳腺癌患者中表达水平都降低,而且与肿瘤分期有关。在随访时间内,Ⅲ期乳腺癌患者和HLA-L、HLA-A、HLA-B mRNA的低水平表达不受手术和化疗的影响。2、流式细胞术检测外周血淋巴细胞及其亚群细胞表面MHC-Ⅰ蛋白的表达。外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞和B细胞表面虽然表达不同水平的MHC-Ⅰ分子,但在乳腺癌患者中的变化却比较一致,表现为进展晚期的Ⅲ、Ⅳ期患者表达水平降低,而乳腺良性肿瘤、癌前病变和进展早期的Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者与健康人相比没有显著性差异。CD8+T细胞MHC-Ⅰ分子表现出不同的变化情况,在乳腺癌进展早期和晚期表达水平都降低,但肿瘤分期之间没有明显差异。3、荷4T1乳腺癌小鼠,无论是外周血淋巴细胞还是肿瘤浸润淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达均降低,但与肿瘤大小和肿瘤进展无关。外周血和肿瘤浸润淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达改变趋势一致。4、利用针对小鼠MHC-Ⅰ基因的siRNA,成功抑制了细胞毒性T淋巴细胞系CTLL-2 MHC-Ⅰ基因的表达后,CTLL-2细胞的杀伤活性降低；通过抗小鼠MHC-Ⅰ单克隆抗体封闭DC细胞诱导的4T1抗原特异性CTL细胞表面MHC-Ⅰ分子,也减弱了CTL细胞的杀伤功能。CTL细胞的杀伤功能受到其表面MHC-Ⅰ分子的调节。5、构建小鼠皮肤移植模型,成功诱导急性排斥反应,外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA在排斥反应发生时非常显著升高,且早于肉眼可见的排斥反应时间。但发生排斥反应的荷乳腺癌小鼠,虽然其外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA依然高度表达,但没有改变肿瘤的生长情况,没有获得有效的抑瘤效果。结论1、进展晚期的乳腺癌患者外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达降低,其中HLA-B位点在肿瘤进展早期即降低,且与肿瘤分期有关。乳腺癌患者CD8+T细胞MHC-Ⅰ的改变比其他淋巴细胞亚型更早。同时排除年龄和治疗(手术、化疗)的影响。外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ可能提示肿瘤患者的免疫失衡状态。2、在基因水平抑制CTL细胞MHC-Ⅰ基因的转录,或者是抗体封闭CTL细胞表面的MHC-Ⅰ蛋白,都能够有效降低CTL细胞的杀伤活性。通过调节MHC-Ⅰ,可以调节CTL细胞的杀伤活性,有望成为肿瘤疫治疗的新靶点。