论文部分内容阅读
西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)和流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)均属于黄病毒科黄病毒属成员，是感染人的嗜神经性病原，病毒通过蚊子叮咬进行传播。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是另一种通过蚊子进行传播的急性传染病病原。对CHIKV和WNV引起的感染至今依然没有临床审批的疫苗和药物用于预防和控制。近年来随着人口迅速增长、城镇化快速发展、人口的频繁流动，以及全球气候变暖，扩大了虫媒病毒的传播范围，病毒感染人数不断增加。当前全球人口均面临虫媒病毒感染的威胁，迫切需要加速病毒复制和致病机制，以及疫苗研发进程。本研究利用反向遗传学技术，通过构建报告病毒和重组病毒，为WNV流行病学调查、疫苗研发、致病机制，以及抗病毒药物筛选提供物质基础和技术支持。同时通过以JEV载体的CHIKV重组病毒疫苗研究，初步探索JEV作为疫苗载体的可行性。本研究分为两个部分： 第一部分：关于WNV报告病毒构建及应用的研究。在WNV感染性克隆的基础上，将能分泌到细胞外表达的报告基因Gaussia luciferase(Gluc)插入到WNV基因组的5UTR与Capsid基因交界处，构建WNV报告病毒感染性克隆重组质粒。构建时在报告基因两端分别引入WNV Capsid N端前33个氨基酸(Capsid33)，以保证病毒基因组的环化不受影响;在报告基因的C端引入FMDV的2A裂解位点，以保证报告基因表达蛋白的正确切割。体外转录的WNV-Gluc报告病毒RNA转染至BHK-21细胞后能够拯救出具有感染性的报告病毒。由于病毒稳定性较差，报告基因在细胞传代过程中迅速丢失，我们通过噬斑纯化的方法筛选出遗传性稳定的WNV-Gluc报告病毒(＞107 PFU/mL)。通过对报告病毒稳定株进行基因组测序，发现在不同稳定株的Capsid中参与病毒基因组环化的区域中出现如下突变:AAT-AAC(N15N)、ATG-ACG(M16T)和ATG-CTG(M16L)。根据RNA二级结构预测，这些位点突变可能会破坏原本的病毒基因组3UTR端与5UTR端的环化，从而促进病毒基因组3UTR与Capsid33中相应区域的环化作用，从而提高报告病毒的稳定性。WNV-Gluc产生的噬斑小于WNV-WT野生型病毒，并且报告病毒的Gluc荧光信号值与病毒滴度之间具有良好的线性关系。以该报告病毒为平台，我们建立了基于Gluc荧光素酶的WNV中和抗体检测方法。通过测定四株WNV人源化抗体的中和抗体水平发现，与传统的噬斑减少中和试验测定结果相比，二者检测结果没有明显的差异。并且前者更加敏感、快速，能满足WNV流行病学调查中的高通量要求。同时该报告病毒也可作为WNV抗病毒药物筛选的有力工具。 第二部分：采用和WNV-Gluc报告病毒相似的构建策略，在JEVSA14株感染性克隆基础上，将全长或截短的CHIKV保护性抗原基因E2和E1插入到JEV基因组5UTR与Capsid基因之间，分别构建了JEV-CHIKV-E2(1-227aa)、JEV-CHIKV-E2(225-423aa)、JEV-CHIKV-E2-FL、JEV-CHIKV-E1-FL、JEV-CHIKV-E3E2-FL等重组病毒感染性克隆。通过间接免疫荧光试验(IFA)验证，所构建的重组病毒均拯救成功，并且在BHK-21细胞中增殖良好。为了提高重组病毒的稳定性，对其基因组Capsid参与环化作用的区域上进行ATG-ACG(M16T)碱基突变。突变后重组病毒稳定性虽然有所提高，但是依然不能到达疫苗候选株的要求。为了进一步提高重组病毒的稳定性，在碱基突变的基础上，我们通过传统的噬斑纯化方法最终筛选出较为稳定的JEV-CHIKV-E2/E1重组病毒，尤其外源片段较短的JEV-CHIKV-E2(1-227aa)和JEV-CHIKV-E2(225-423 aa)细胞中连续传代至P8代以上仍很稳定。选用JEV-CHIKV-E2(1-227aa)、JEV-CHIKV-E2(225-423 aa)、JEV-CHIKV-E2-FL、JEV-CHIKV-E1-FL四株重组病毒，通过小鼠免疫试验评价其免疫效果。动物试验结果表明，上述四株重组病毒首次和加强免疫后，均仅检测到JEV特异性抗体，未检测到CHIKV特异性抗体，是否诱导产生了CHIKV相关的细胞免疫反应还需要进一步评价。