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前言 腹膜透析（PD）作为终末期肾衰竭（ESRF）替代治疗的有效手段之一，其长期有效的进行有赖于腹膜保持良好的透析效能。PD时腹膜持续暴露于酸性、高渗透压、高葡萄糖浓度的非生理性透析液，导致第一道生理屏障——腹膜间皮细胞（PMCs）发生显著的形态学改变：如细胞表面微绒毛消失、细胞增大甚至细胞剥脱，间皮细胞下基质增多，一些病人可出现基底膜增厚及间质中微血管壁增厚等糖尿病样病变，认为是暴露于极高葡萄糖浓度（83～234mmol／L）的透析液所致。上述结构改变会影响腹膜的透析效能：腹膜的通透性增加，葡萄糖（Glc）吸收加快，导致超滤（UF）下降。可见高糖是造成PMCs损害进而导致透析效能下降、超滤能力丧失的主要原因。因此有必要研究和探讨高糖对PMCs的损伤机制及PMCs对Glc的吸收机制，而PMCs的体外培养则为该研究提供了细胞模型。 Glc的摄取是己糖激酶（HKs）和细胞膜上葡萄糖转运蛋白（GLUTs）在功能上相互偶联的结果。HKs是在ATP和Mg2+存在的条件下，将经GLUTs易化扩散进入细胞的Glc磷酸化为6-磷酸葡萄糖，是Glc进入代谢途径的第一步反应。该反应一方面保证了细胞内外Glc的浓度梯度，使其连续不断的进入细胞内；同时也为Glc进入其它代谢途径提供了共同底物（6-磷酸葡萄糖）。因此细胞内HKs活性变化，决定了细胞对Glc的摄取。 已有实验证实：肾小球系膜细胞的HKs活性在糖尿病相关因素：蛋白激酶C（PKC）激活剂——佛波酯（PMA、PDD）的作用下上调，并伴有细胞对Glc净利用的增加，从而参与了糖尿病肾病的发生发展。而PMCS在PD时暴露于高糖透析液中，是否这种暴露也刺激了 HKS在PMCS的表达呢？因此有必要研究作为 GIC代谢关键酶之一的HKS是否参与了上述病理过程。 关于HKS在PMCS的表达国内外尚未见报道。本实验利用原代培养的PMCS，主要研究糖尿病相关因素：高糖JMA及PDD等PKC激活剂对PMCS的HKS活性的调节，检测HKS活性与0 摄取的相关性；并观察经典型PKCkPKC )抑制剂一e976对HKS活性的影响，为进一步探讨如何减少 GIC的吸收从而增加 UF提供新的理论依据。 实验材料 l、实验动物：雄性SD大鼠 2、实验用细胞：原代培养的腹膜间皮细胞 3、细胞培养、传代及鉴定的相关试剂 4、检测己糖激酶活性及葡萄糖含量的相关试剂 实验方法 1、胰蛋白酶消化法进行大鼠PMCS的原代培养 2、间接免疫荧光法用于PMCS的鉴定 3在一磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法检测总HK活性 4、观察高糖、佛波酯及CPKC抑制剂对HKS活性的调节 5上色法检测细胞培养液中葡萄糖减少的量，观察细胞对葡萄糖的净利用能力。 ·2· 实验结果 ＼胰蛋白酶消化20 dn、先弃消化液再用胎牛血清厂BS)吹打收集细胞及培养液含FBS浓度为10％的条件下，原代培养所获细胞的贴壁率高、纯度及生长良好，5－sd可达融合，形成铺路石样外观。经免疫荧光鉴定：细胞角蛋白抗体在胞浆内呈绿色荧光，证实培养的细胞是腹膜间皮细胞。 2、PMCs的基础 HKs活性为（4．80。0．39）U／g蛋白。 3、葡萄糖对HKs活性的诱导呈浓度依赖性 葡萄糖浓度为 2．5％和 4．25％的培养液刺激 PMCS 24 h后，＊征活性分别提高65．9 ％及so啪(P＜O．05人而渗透压对照组 4．25％的甘露醇对 HKS的诱导为 3．2％(P＞0．05人 4JMA对HKS活性的诱导呈剂量和时间依赖性，同时伴有GIC净利用的增加。 ①PMCs暴露于PM人浓度为0．01 pmo＊L、0．lpmol／L及二卜moUL的培养液24 h后，HKs活性分别提高30．7％J9．9％及99．二％（P SO．00）。 ②PMCs暴露于…moVL PMA后，分别在 lh、3 h、6 h、12 h。18 h、24 h、30 h及 36 h检测 HKS活性。明显的诱导出现在刺激后12 h门8．5％，P＜0．0（）厂 HKS活性的最大诱导时间出现在刺激后24 h（pp．4％，P＜O．00）。 ③PMCs暴露于 1卜moVL PMA 18 h后，细胞对0c的净利用明显增加小．6nunol，P＜o．00＊，24卜培养液内的＊c基本消耗一半K，P北．皿1X与未经＊＊A刺激的细胞对比mc净利用差异显著（P＜o．05）。 5、佛波酯对HKS活性的诱导具有PKC特异性 PMCs暴露于 PDD浓度为0．001 po＊L、0．of pmo＊L及0．l ·3·1llllol／L的培养液24 h后，HKS活性分别提高25．3％52．5％及83．6畅(P＜O．01人而相同条件下4a－P＊D对＊Ks活性的诱导分别为6．6％3．4助及4．9呢（P＞O．05）。 6、Glib976抑制了 PMA对 HKS活性的诱导 PMCs暴露于浓度为10 pmo＊L二0 pmo＊L、30 pmo＊L、40umo＊L及50 umol／L的 e976预处理30 dn后，再予三卜mol／LPMA培养24 h，H征活性分别抑制了 14．6％、26．8％、34．2畅、44．2％及54．9％(P＄0．001人 讨 论 一、腹膜间皮细胞的体外培养 PMCS是构成?