口腔颌面部头颈癌是我国主要的恶性肿瘤之一,发病率位居全身癌的第六位,舌鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,其中局部的浸润复发、颈部淋巴结的转移扩散是舌鳞癌预后不良的首要原因。尽管舌鳞癌的综合治疗措施在不断的发展完善,但一旦出现转移,其治疗仍不能获得满意效果,早期舌鳞癌5年生存率可达70%,而晚期舌鳞癌5年生存率仅为30%。因此,加强对舌鳞癌发生发展病因、机制的基础研究,阐明舌鳞癌侵袭转移的分子机制,对舌鳞癌发生发展进行预测、早期诊断和预后判断是舌鳞癌研究的前沿课题,对于提高舌鳞癌治愈率、减少死亡率具有重要的科学意义。研究表明在癌细胞侵袭转移的过程中,发挥作用的除了行使执行功能的蛋白分子外,RNA也在其中发挥重要功能,最近的研究识别了一些与癌侵袭转移及预后相关的标志分子包括蛋白编码基因和miRNAs。 RNA不仅仅是DNA和蛋白质之间的信息桥梁,而且在机体的多种生命活动中发挥着重要作用。其中非编码RNA在生命过程中扮演着不同的重要角色,如功能已被广泛认可的tRNA、miRNA等。最近的研究显示在许多组织异常表达的长链非编码RNAs （long noncoding RNAs, IncRNAs）通过特定的癌基因或抑癌基因在肿瘤发生发展过程中起着非常重要的作用。长链非编码RNA （lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们并不直接参与蛋白质的编码,起初一直被认为是基因组转录的γ噪音”,是转录的副产物,并不具备生物学功能。但由于哺乳动物染色体转录的RNA数量庞大,而编码蛋白质的mRNA只有2%左右,另外剩余大量的非编码RNA除了我们所熟悉的miRNA,siRNA等外,还存在着大量的尚未被认知的lncRNAs,在肿瘤学研究中,lncRNA异常表达主要表现以下三个方面：一是一些lncRNA可能仅仅在某些肿瘤中呈特异性表达,如DD3在前列腺癌中的特异性表达；二是很多IncRNA不仅仅在一种肿瘤中呈过表达（如MALAT1在肺癌、肠癌、神经母细胞瘤中均存在过表达）；三是一些肿瘤中可能不止一种lncRNA呈过表达[例如在前列腺癌中PCGEM1, DD3（PCA3）, PCAF1均发现表达异常]。另外,研究发现IncRNAs与肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关,如MALAT1促进肺癌细胞的侵袭转移,HOTAIR在乳腺癌侵袭转移过程中的作用。愈来愈多的研究证实IncRNAs在肿瘤发生发展的过程中发挥着重要作用。目前lncRNA的研究仍处于起步阶段,由于lncRNA功能复杂多样,既存在促进肿瘤发生发展的促癌因子,也存在抑制肿瘤生长的抑癌因子,目前对IncRNA在肿瘤发生发展过程中所扮演的角色和功能作用等仍不明确。我们对lncRNA功能的深入研究将为其在肿瘤发生发展及侵袭转移过程中的作用带来全新的认识。随着人类基因组内越来越多的lncRNA被鉴定出来,人们发现lncRNA所介导的复杂网络调控着数量众多的编码基因,因此lncRNA在肿瘤学研究中具有重要价值,寻找IncRNA分子及其靶基因的研究已成为基因调控和肿瘤学研究领域的重要分支和热点。因此lncRNA在恶性肿瘤中的特征性表达谱使其有望成为新的肿瘤诊断及预后评估的生物学指标,而异常表达的lncRNA也可直接或间接调控靶基因,参与肿瘤发生发展及侵袭转移等过程。截至目前,IncRNA在口腔肿瘤中的研究鲜见报道,因此,对IncRNA的表达谱及其对基因调控的作用机制研究也为舌鳞癌的相关研究增添了一个新的切入点。本实验分为以下三部分：第一章舌鳞癌组织与正常舌组织差异表达IncRNAs的筛选研究目的：本研究利用微矩阵基因芯片技术,研究IncRNA在舌鳞癌组织和正常舌组织之间表达谱的差异,探讨IncRNA在基因调控中可能存在的作用,并初步探讨IncRNA和舌鳞癌之间的关系。研究方法：1.随机选取3例舌鳞癌组织和3例正常舌组织分别设定为实验组（舌鳞癌组织组）和对照组（正常舌组织组）。随后对选取的6例组织标本进行处理,抽提总RNA,然后对提取所得的RNA进行质量检测；2.对质量检测符合纳入标准的组织样本,合成cDNA,完成基因芯片杂交,对杂交芯片采取Agilent Microarray Scanner软件进行扫描,然后用Feature Extraction software10.7软件对扫描所得数据进行分析,再用Gene Spring Software11.0软件对前述结果进行归一化处理,最后得到mRNA和IncRNA数据；3.采用折叠倍率（Fold Change）法进行差异基因筛选。首先设定差异基因筛选标准,以Fold Change>2,p<0.05作为差异基因纳入标准,获得差异mRNAs和IncRNAs表达谱,并通过散点图（Scatter Plot）和火山图（Volcano Plot）对差异mRNAs和IncRNAs直观标示,然后再采用软件Gene Spring Software11.0对数据进行聚类分析。研究结果：1.以实验设定的标准作为差异基因筛选标准（Fold Change>2,p<0.05）,芯片筛选的结果表明,在实验组和对照组两组不同的组织芯片中,mRNAs和IncRNAs的表达谱有明显差异,其中差异mRNAs有2696个,差异IncRNAs有3590个；2.在筛选所得的差异mRNAs2696个中,上调的mRNAs有1888个,下调的mRNAs有808个,上调的mRNAs明显高于下调的mRNAs。其中NM₀02425是上调倍数最大的mRNA,上调倍数为3443.299,NM₀33185是下调倍数最大的mRNA,下调倍数为142.1286250966048；研究结论：1. IncRNA microarray基因芯片是筛选舌鳞癌差异表达基因的一种高通量、高效率检测手段；2.首次利用IncRNA microarray基因芯片研究舌鳞癌的IncRNA基因表达谱,经Microarray基因芯片检测,对实验组和对照组两组基因表达谱进行相比,差异IncRNAs有3590个,上调的IncRNAs有1785个,下调的IncRNAs有1805个；同时检测到有2696个mRNAs表达有差异,其中上调表达1888个,下调表达808个。这提示IncRNA可能是全新的舌鳞癌标记物和潜在的基因治疗靶点。第二章舌鳞癌组织与正常舌组织差异表达IncRNAs的实时荧光定量PCR验证研究目的：我们通过基因芯片对差异基因进行筛选,表明实验所采用的IncRNA microarray基因芯片是一种高通量、高效率的检测手段,并且依据基因芯片筛选得到若干差异表达的IncRNAs,为进一步明确该芯片的准确性,我们从上调和下调的若干IncRNAs中分别随机挑选出3个IncRNAs在50例舌鳞癌组织和15例正常舌组织以及4种舌鳞癌细胞和1种正常舌细胞中进行SYBRGREEN I实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）验证（3个上调的IncRNAs:uc002ect, NR₀26800,LIT1923,3个下调的IncRNAs:THC2631745, ENST00000494340, NR₀27044.1）,以进一步明确IncRNA microarray基因芯片的准确性。研究方法：对挑选的3个上调的IncRNAs和3个下调的IncRNAs在50例舌鳞癌组织和15例正常舌组织以及4种舌鳞癌细胞和1种正常舌细胞中采用RT-PCR验证,并用GAPDH做内参。研究结果：结果表明,对挑选的6个IncRNAs采用RT-PCR进行验证,RT-PCR结果在舌鳞癌组织和舌鳞癌细胞中显示uc002ect,NR₀26800,LIT19233个基因表达上调,THC2631745,ENST00000494340,NR₀27044.13个基因表达下调，和前面实验中基因芯片所筛选的结果基本吻合。研究结论：1. IncRNAs （uc002ect, NR₀26800, LIT1923,THC2631745, ENST00000494340, NR₀27044.1）在舌鳞癌组织和细胞中存在差异表达,提高了芯片结果的可信度；2.进一步表明IncRNA microarray基因芯片是一种高通量的、高效率的检测手段,是筛选舌鳞癌差异表达基因的一种理想有效的方法。第三章舌鳞癌组织与正常舌组织差异表达lncRNAs的生物信息学研究研究目的：初步探讨实验组和对照组中差异表达的lncRNAs在基因调控中可能发挥的作用,并通过利用生物信息学手段研究分析差异表达的lncRNAs在舌鳞癌发生发展过程中的生物学作用。研究方法：综合NCBI RefSeq、 NCBI Other、 UCSC、ENSEMBL、 Homolog、 LNCRNA-DB ncRNA-SCAN、 Agilent-G3、 Agilent Other及Other Database等多个数据库的资源,对芯片的结果进行生物信息学分析（Gene Ontology、 Pathways分析等）,并通过计算差异表达的mRNAs和IncRNAs Pearson之间的相关系数构建IncRNA与mRNA的基因共表达网络图。研究结果：GO （Gene Ontology）分析显示：生物学进程（biological process,BP）方面,差异表达的mRNAs主要富集在11个生物学进程中,其中排第一的是immune system process这一生物学进程,含有差异表达基因215个,占该进程中所有基因数的1.3%。排在第二、第三的生物学进程分别为locomotion和biologicaladhesion,分别包含差异基因数为91和219,分别占各自所在生物学进程中所有基因数的比例为0.5%和0.8%；在细胞组件（cellular component, CC）方面,差异表达的mRNA基因主要富集在12个细胞组件中,其中排第一的是extracellular region part这一细胞组件,含有差异表达基因197个,占该细胞组件中所有基因数的1.2%。排在第二、第三的细胞组件分别为extracellular space和extracellular matrix,分别含差异基因数为141和74,分别占各自所在细胞组件中所有基因数的比例为0.8%和0.4%；在分子功能（molecular fimction, MF）当中,差异表达的mRNA基因主要富集在11个分子功能中,其中排第一的是signal transducer activity这一分子功能,含有差异表达基因296个,占该分子功能中所有包含基因数的1.8%。排在第二、第三的分子功能分别为extracellular matrix structural constituent和carbohydrate binding,分别含差异基因数为24和61,分别占各自所在分子功能中所有基因数的比例为0.1%和0.4%。通过KEGG分析发现,差异表达的mRNA基因主要富集在27个生物学途径中,其中排第一的是Cytokine-cytokine receptor interaction这一生物途径，含有差异表达基因71个。排在第二、第三的生物学途径分别为Chemokine signaling pathway和Leukocyte transendothelial migration,分别含差异基因数为48和31。我们对差异表达的基因计算各自之间的Pearson相关系数,构建IncRNA-mRNA即编码-非编码基因共表达网络（coding-noncoding geneco-expression network）。研究结论：1.GO分析：差异mRNAs分布在11个生物学进程、12个细胞组件和11个分子功能中.KEGG分析：差异mRNAs分布在27个生物学途径中；2.通过构建共表达网络图,初步分析IncRNA参与舌鳞癌发生发展的基因网络图,生物信息学初步分析显示这些IncRNA在舌鳞癌的发生发展中发挥复杂的调控作用,IncRNA可能是全新的舌鳞癌标记物和潜在的基因治疗靶点全文结论：1. IncRNA microarray基因芯片是筛选舌鳞癌差异表达基因的一种理想有效的方法；2.首次利用IncRNA microarray基因芯片筛选出舌鳞癌组织和正常舌组织中存在的差异表达的IncRNAs,并利用实时荧光定量PCR对其中异常表达的部分IncRNAs予以验证,提高了芯片检测结果的可信性,最后,利用生物信息学技术分析,表明差异表达的IncRNAs在舌鳞癌的发生发展中可能发挥着重要作用；3.G0分析：差异mRNAs分布在11个生物学进程、12个细胞组件和11个分子功能中,KEGG分析：差异mRNAs分布在27个生物学途径中,通过构建共表达网络图,初步分析IncRNA参与舌鳞癌发生发展的基因网络图,生物信息学初步分析显示这些IncRNA在舌鳞癌的发生发展中发挥复杂的调控作用,IncRNA可能是全新的舌鳞癌标记物和潜在的基因治疗靶点。