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血浆脂蛋白(a)[LP(a)]是人类血浆中一个遗传性质复杂的脂蛋白。LPA基因[包括Kringle IV拷贝数和单核苷酸多态性(SNP)]是决定LP(a)浓度变化的主要因素,对于动脉粥样硬化(AS)和冠状动脉心脏疾病(CDH)来说高脂蛋白(a)水平是其发生的独立危险因子。但至今为止仍然缺少专一有效的方法来下调高Lp(a)血症患者血浆中的Lp(a)水平,目前临床上也是缺乏高效安全降低血浆LP(a)水平的治疗方法,但是经过一系列研究发现通过单采高风险患者降低高血浆LP(a)水平与最大限度地降低低密度脂蛋白胆固醇水平可以显著降低冠脉事件的发生。载脂蛋白(a)[apo(a)]它是LP(a)的特异性抗原,大量的研究表明Lp(a)血浆浓度个体差异非常大,并因为apo(a)基因的表达而呈现出高度遗传性,而生活方式、年龄等对Lp(a)水平影响甚微。所以降低apo(a)的合成是目前下调血浆中Lp(a)的主要策略。有一些研究发现激活胆汁酸受体(法尼醇X受体,FXR)后可以通过与LPA启动子上正向重复元件1中的-826和-814之间区域的调控元件DR-1位点相结合,并可以发挥抑制LPA基因转录的作用,从而起到抑制Lp(a)表达的作用。肝细胞核转录因子4α(HNF4α)也可竞争性地结合到LPA基因启动子的该区域发挥促进LPA基因转录的作用,而HNF4α与FXR结合到LPA基因启动子DR-1位点的平衡失调,也可能是引起apo(a)表达水平改变的一个原因。早期的研究已经证实硫化氢(H2S)具有广泛的生物学效应如参与了体内的糖脂代谢、细胞的增殖与凋亡及血管新生等的调节。而现在,越来越多的研究人员在关注H2S对AS的调节作用,然而迄今为止,许多的研究结果表明H2S发挥抗AS的机制包括H2S可通过抑制血管平滑肌细胞的增殖、内皮细胞分泌粘附分子表达及同型半胱氨酸诱导的血管损伤等,其中蛋白激酶Cα(PKCα)和蛋白激酶B(AKT)通路是H2S调控糖脂代谢的两条较为经典的信号通路,最近有研究证明PKCα和AKT可分别通过激活FXR及HNF4α而在Hep G2细胞中起调节作用,而FXR和HNF4α也是调节血浆中脂蛋白(a)水平的较为常见的信号分子,故H2S存在下调apo(a)表达的分子作用潜质。基于此,本课题旨在探究H2S对Hep G2细胞apo(a)表达的影响及其机制研究,为研究下调Lp(a)特异型药物提供新的靶标和方向。第一部分:H2S对Hep G2细胞apo(a)表达的影响[目的]观察H2S对Hep G2细胞apo(a)表达的影响。[实验方法]用含10%胎牛血清的高糖培养基培养Hep G2细胞,待培养瓶中的细胞生长至70%左右时,再换含有不同浓度硫氢化钠(Sodium hydrosulfide,Na HS)(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)的新鲜无血清培养基培养24h;及用200μmol/L Na HS处理不同时间(0、6h、12h、24h);用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测apo(a)的蛋白表达水平,用RT-PCR的方法检测apo(a)m RNA表达,ELISA法测定细胞培养液中apo(a)分泌水平。[结果]与对照组相比,随着Na HS浓度的增加,Hep G2细胞内的apo(a)表达水平及apo(a)分泌水平呈浓度依赖性下降,其中以100μmol/L、200μmol/L降低效果明显;而与对照组相比,随着Na HS作用时间的延长,Hep G2细胞内的apo(a)表达水平及apo(a)分泌水平呈时间依赖性下降,其中以24h的下降作用最为显著。[小结]Na HS呈浓度依赖性及时间依赖性降低Hep G2细胞中apo(a)蛋白和m RNA的表达及其分泌水平。第二部分:H2S调控Hep G2细胞apo(a)表达的机制[目的]探讨H2S影响Hep G2细胞apo(a)表达的分子机制。[实验方法]用无血清高糖培养基培养Hep G2细胞,分别用FXR si RNA,HNF4αsi RNA,PKCα特异性抑制剂Calphostin C,AKT特异性抑制剂LY294002对细胞进行预处理,随后加入200μmol/L Na HS处理细胞24h。用Western blot法检测Hep G2细胞中FXR、HNF4α、PKCα、M-PKCα、AKT、p-AKT及apo(a)表达,同时运用RT-PCR的方法检测细胞中apo(a)m RNA的表达变化,ELISA法测定细胞培养基中apo(a)分泌水平变化。[结果]H2S显著上调FXR、M-PKCα及p-AKT表达,而下调HNF4α表达;抑制PKCα及AKT激活可以反转H2S对Hep G2细胞中apo(a)蛋白表达的抑制作用;干扰FXR也可起到相同的效果;而干扰HNF4α后,由于HNF4α干扰后其上游的因子可能通过调节其他因子,或是其竞争性抑制物FXR反应性增加从而使apo(a)增加不明显。[小结]H2S通过PKCα-FXR和Akt-HNF4α通路协同下调Hep G2细胞中apo(a)表达。[结论]1.H2S时间及剂量依赖性抑制apo(a)表达;2.H2S通过PKCα上调FXR抑制apo(a)表达;3.H2S通过AKT下调HNF4α抑制apo(a)表达。