【摘 要】
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目的:筛选与TNF-α转化酶胞内区相互结合的蛋白,进一步探讨TNF-α转化酶胞内区的生物学功能。 方法:利用蛋白质相互作用原理,应用酵母双杂交系统对小鼠睾丸cDNA文库进行筛选。
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目的:筛选与TNF-α转化酶胞内区相互结合的蛋白,进一步探讨TNF-α转化酶胞内区的生物学功能。
方法:利用蛋白质相互作用原理,应用酵母双杂交系统对小鼠睾丸cDNA文库进行筛选。(1)通过PCR方法扩增编码TNF-α转化酶胞内区(Tumor necrosis factor-α converting enzyme cytoplasm domain,TACEc)的DNA片段,并克隆进入pGBKT7载体,从而构建“诱饵”质粒pGBKT7-TACEc;(2)将“诱饵”质粒pGBKT7-TACEc转化酵母菌AH109,然后将被转化的酵母菌分别涂布在SD/-Trp和SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu于培养基平板上,以观察“诱饵”蛋白自我激活报告基因与否; (3)在SD/-Trp液体中培养16 h后,测AD<,600>值,观察“诱饵”蛋白有无酵母毒性作用;(4)将已被“诱饵”质粒转化的AH109与小鼠睾丸cDNA文库进行杂交,筛选阳性克隆,分离阳性克隆中的cDNA进行验证,并测序和Blast比对分析。
结果:获得的目的基因片段大小与预期结果相同;经酶切鉴定和序列分析证实成功构建了pGBKT7-TACEc重组质粒;转化酵母菌AH109的pGBKT7-TACEc“诱饵”质粒不会自我激活报告基因;同时也没有酵母毒性作用;对小鼠睾丸cDNA文库筛选得到4个准阳性克隆,其中1个Ran结合蛋白M(RanBPM),1个分类连接蛋白3(sorting nexin 3),2个未知功能蛋白基因。
结论:成功筛选出肿瘤坏死因子-α转化酶胞内区相互作用蛋白,为进一步研究肿瘤坏死因子-α转化酶胞内区作用提供了新线索。
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