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固有免疫系统是保护宿主免受病原体侵害的第一道屏障,可以借助种系编码的模式识别受体识别来自病原微生物的危险信号——病原体相关分子模式以及宿主自身来源的危险信号——危险相关分子模式。目前已发现的模式识别受体有四大类,包括TLRs、CLRs、RLRs以及NLRs。不同于其他模式识别受体,一部分NLRs的家族成员可以形成炎症体、调节caspase-1活性,后者影响IL-1β的成熟和分泌。NLRP3是目前研究最为深入和广泛的一种炎症体,在多种疾病的病理过程发挥非常重要的作用。本研究组前期研究结果表明,NLRP3炎症体在人牙髓成纤维细胞(Human dental pulp fibroblasts,HDPFs)中表达,并且与牙髓固有免疫以及损伤修复具有非常密切的关系。但NLRP3炎症体在牙髓成纤维细胞中的作用如何?那些因素参与NLRP3表达的调控?其激活机制又是如何?这些问题目前尚不清楚。阐明这些问题有助于加深对牙髓组织固有免疫的理解,并为寻找牙髓炎症新的治疗方法奠定基础。研究目的:1.探讨NLRP3炎症体在HDPFs中的作用及作用机制2.探讨牙HDPFs中NLRP3炎症体的激活机制3.探讨HDPFs中NLRP3的转录调节机制4.探讨HDPFs中NLRP3的转录后调节机制方法:1.用LPS和ATP刺激HDPFs,RT-PCR和western-blot检测NLRP3炎症体相关基因的表达水平,ELISA检测细胞外IL-1β浓度。通过构建sh RNA慢病毒载体分别沉默NLRP3和caspase-1,观察两种基因对HDPFs细胞分泌IL-1β的影响。2.利用荧光染料标记细胞内ROS和超氧化物,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测ATP刺激对HDPFs中ROS水平的影响;利用ROS抑制剂阻断ROS的生成,western-blot和ELISA检测p20表达水平和IL-1β分泌水平,观察其对NLRP3炎症体活性的影响。3.利用CLI-095、Pepinh-MYD和Bay 11-7082分别抑制TLR4、My D88和NF-κB,LPS刺激HDPFs,RT-PCR和western-blot检测NLRP3、caspase-1及IL-1βm RNA表达水平,ELISA检测细胞外IL-1β浓度。4.RT-PCR检测LPS和ATP刺激时HDPFs中mi R-223和mi R-22表达水平;荧光素酶报告检测确认mi R-223和mi R-22与靶基因NLRP3的结合;转染mi RNA mimics过表达mi R-223和mi R-22,western-blot和ELISA检测NLRP3炎症体活性。结果:1.LPS刺激引起NLRP3、caspase-1和IL-1βm RNA表达水平升高;LPS和ATP共同刺激引起HDPFs释放IL-1β;沉默NLRP3和caspase-1均可抑制IL-1β的分泌,但对IL-1βm RNA表达水平无影响。2.ATP刺激诱导HDPFs产生大量ROS;ROS抑制剂可抑制ATP刺激引起的p20的表达和IL-1β分泌。3.抑制TLR4可显著抑制NLRP3、caspase-1和IL-1βm RNA表达水平,而抑制My D88和NF-κB仅可抑制NLRP3和IL-1βm RNA表达水平,对caspase-1的表达无明显影响。4.RT-PCR结果证明mi R-223和mi R-22在HDPFs中确有表达,LPS刺激导致二者表达水平下降,荧光素酶报告检测结果证实mi R-223和mi R-22均可与NLRP33’UTR结合;过表达mi R-223和mi R-22会导致NLRP3蛋白表达水平下降,IL-1β分泌减少。结论:1.NLRP3炎症体对HDPFs细胞IL-1β的分泌起关键调节作用2.ATP激活NLRP3炎症体依赖细胞内ROS的产生3.TLR4-My D88-NF-κB信号通路调节NLRP3的表达水平4.mi R-223和mi R-22可抑制NLRP3蛋白表达并降低NLRP3炎症体活性