论文部分内容阅读
研究背景和目的喉鳞状细胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是头颈部发病率最高的恶性肿瘤之一,也是第二大呼吸道高发癌。LSCC 一般按照肿瘤大小(Tumorsize,T)、颈部淋巴结转移(Cervical lymph node metastasis,N)及远处转移(Distant metastasis,M)对其分期。原位癌的淋巴转移直接影响其治疗方式、患者生存期,研究报道,LSCC颈部淋巴结转移率分别约为:T1 6-25%、T2 30-70%、T3及T465%-80%。一般LSCC预后不良的因素包括T、N分级升高及出现远处转移等。然而,对于喉鳞状细胞癌临床预后影响因素的相关文献报道尚不一致。因此,本研究第一部分旨在研究不同临床病理因素对LSCC预后的影响。葡萄糖是肿瘤细胞增殖、分化、侵袭及转移的主要能量来源,细胞对葡萄糖摄取主要依赖葡萄糖转运蛋白(glucosetransporter,Glut),其中Glut-1是细胞摄取葡萄糖的主要载体。与正常细胞相比,肿瘤细胞自身更偏好于在厌氧环境中利用糖酵解途径产生能量,为适应肿瘤微环境,大多数恶性肿瘤细胞都高表达Glut-1以满足其能量的需要,因此,Glut-1作为恶性肿瘤基因治疗的重要靶点成为近年来肿瘤研究领域的热点。Glut-1与肿瘤细胞生长、迁移有着密切的关系。大量研究报道,抑制肿瘤细胞Glut-1的表达能有效抑制恶性肿瘤细胞增殖、迁移、诱导细胞周期阻滞及凋亡。然而,Gult-l抑制对喉癌细胞生长及迁移的影响及其分子机制却很少被报道。因此,本研究第二部分旨在探讨Gult-1敲低对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡、迁移的影响,并通过研究相关信号通路蛋白及基因的表达探讨其分子机制。自噬在肿瘤细胞生长、迁移中起着重要的作用,是一种真核细胞对损坏的蛋白或细胞器进行降解并循环利用的过程,在肿瘤细胞生长、迁移过程中扮演着促细胞存活与诱导细胞死亡的双重角色。一定程度的自噬促进肿瘤的生长、侵袭,而过度持续的自噬可激活肿瘤细胞自我降解从而导致细胞死亡。自噬相关蛋白Beclinl是细胞发生自噬的重要标志物之一,在诱导自噬开始阶段起着重要作用。研究证明调节恶性肿瘤细胞Glut-1基因及蛋白的表达可以通过影响细胞自噬通路来调节细胞生长、迁移。然而,Gult-1对喉癌自噬的影响及其机制尚缺乏相关文献支撑。因此,探索敲低Gult-1及调节Beclinl表达在喉癌Hep-2细胞自噬中的作用及其对细胞生长、迁移的回复效应成为本研究的主要目的之一。肿瘤生长的微环境在肿瘤的发生、发展、治疗抵抗、复发中具有重要作用,尤其乏氧微环境和肿瘤治疗抵抗、复发关系密切。实体瘤内部乏氧微环境下诱导的新生血管形成、对葡萄糖的摄取和代谢增加是肿瘤对放、化疗抵抗的重要原因。在乏氧的情况下HIF-lα表达急剧升高,激活Glut-1中mRNA过度表达及其产物的大量合成,以便转运更多的葡萄糖以满足恶性肿瘤细胞高代谢率和快速生长的需要,阻断其中的某些重要环节对消除肿瘤治疗抵抗与复发具有重要作用。而目前Glut-1与喉癌化疗耐药关系的研究少见。因此,本研究第四部分旨在了解喉癌Hep-2细胞中Glut-1蛋白表达与肿瘤耐药的关系,并通过RNA干扰阻断喉癌Hep-2细胞Glut-1的表达,阐明Glut-1表达改变影响喉癌Hep-2细胞能量供应及提高喉癌Hep-2细胞化疗敏感性的可能机制。研究方法1.回顾性研究2013年1月-2013年12月71例我院首次治疗的喉鳞状细胞癌患者,分析不同性别、年龄、TNM分期、临床分期、肿瘤位置、病理分化程度、治疗方式等因素对患者预后的影响。2.采用短发夹 RNA(Short hairpin RNA,shRNA)抑制喉癌 Hep-2 细胞 Glut-1蛋白及基因的表达,观察对细胞增殖、凋亡及迁移的影响,并研究其抑制细胞增殖及迁移、促进细胞凋亡的机制。3.通过雷帕霉素或高表达Beclinl从而促进细胞自噬,研究Glut-1敲低+促进自噬对Hep-2细胞增殖、凋亡及迁移的影响,通过敲低Beclin1从而抑制细胞自噬,研究Glut-1敲低+抑制自噬对Hep-2细胞增殖、凋亡及迁移的影响。以此探讨Glut-1在喉癌细胞自噬中的作用及其对细胞生长及迁移的回复效应。4.筛选针对Hep-2细胞有效的Glut-1干扰片段siRNA以及对Hep-2细胞功能影响有效的顺铂浓度;通过RNA干扰抑制Glut-1表达对Hep-2细胞顺铂敏感性的影响,研究Glut-1表达改变影响Hep-2细胞化疗敏感性的可能机制。研究结果1.单因素生存分析显示年龄、T分期、鳞状细胞癌的分化程度、治疗方式对喉鳞状细胞癌患者的生存率影响较小(P>0.05),声门上型患者的死亡率显著高于声门型患者(P<0.05),提示声门上型喉鳞状细胞癌的预后较声门型差;无淋巴结转移的患者其生存率显著高于有淋巴结转移的患者,提示有淋巴结转移的喉鳞状细胞癌其预后较差(P<0.01);临床分期越高,患者死亡率越高,提示喉鳞状细胞癌临床分期越高预后越差(P=0.000)。COX比例风险模型回归分析显示,仅年龄、治疗方式两个变量对患者预后的影响有显著统计学意义(P<0.05)。2.Glut-1敲低显著抑制细胞周期相关蛋白cyclinD1(27%)及细胞增殖相关蛋白c-myc(29%)的表达,从而抑制Hep-2的增殖活性(24h、48h、72h分别约为NC组的87.4%、73.2%、55.8%);Glut-1敲低通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白及基因的表达(约23.2%),促进促凋亡相关的激活的Caspase3蛋白及基因的表达(2.45倍),从而促进Hep-2细胞发生凋亡(Glut-1 shRNA、Control、NC组细胞凋亡率分别约为25.9%、3.2%及3.1%);Glut-1敲低通过上调抑制细胞迁移相关蛋白E-cadherin的表达(约2.1倍),下调促细胞迁移相关蛋白 N-cadherin蛋白及基因的表达(约降低45%),从而抑制喉癌细胞迁移(约降低57.6%)。3.Gult-1敲低能促进细胞自噬,自噬诱导剂雷帕霉素及高表达Beclin1能显著诱导细胞发生自噬,自噬诱导能进一步促进Gult-1敲低细胞的自噬水平;在Gult-1敲低的基础上,过度诱导自噬会进一步降低细胞增殖相关cyclinD1与c-myc蛋白的表达,进一步降低细胞存活率。在Gult-1敲低的基础上,诱导自噬能进一步下调Hep-2细胞抗凋亡相关Bcl-2,上调促凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达,从而进一步促进细胞发生凋亡。在Gult-1敲低的基础上诱导自噬,能促进抑制细胞迁移E-cadherin蛋白及基因的表达,而抑制促细胞迁移N-cadherin蛋白及基因的表达,从而进一步抑制Hep-2细胞的迁移。反之,敲低Beclin1能显著抑制细胞自噬,能有效逆转Gult-1敲低引起的细胞自噬水平的升高,能逆转Gult-1敲低引起的细胞增殖活性降低,上调细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,有效逆转Gult-1敲低诱导的细胞凋亡,自噬抑制能有效逆转Gult-1敲低诱导的细胞迁移能力降低的效应。4.在4组RNA干扰抑制Hep-2细胞Gult-1表达组中,siRNA726组的抑制效果最佳,并同时对MRP1基因产生抑制;在3种不同顺铂浓度对喉癌Hep-2细胞功能影响中,3μg/mL的顺铂浓度对Hep-2细胞抑制增殖、促进凋亡作用效果最好;Hep-2细胞RNA干扰抑制Glut-1表达后可以抑制MRP1基因及蛋白的表达,顺铂可以上调Hep-2细胞RNA干扰抑制Glut-1表达后MRP1基因及蛋白的表达,且RNA干扰抑制Glut-1对MRP1基因及蛋白的抑制作用大于顺铂的促进作用。主要结论1.年龄、N分期、临床分期、肿瘤位置、治疗方式等因素可能对喉鳞状细胞癌患者的预后有一定影响。2.Gult-1的敲低能抑制Hep-2细胞的增殖;促进Hep-2细胞发生凋亡;抑制Hep-2细胞迁移。3.shRNAGlut-1及诱导自噬可以影响喉癌Hep-2细胞生长、迁移;shRNA Glut-1可以通过影响自噬调节喉癌Hep-2细胞生长、迁移。4.RNA干扰抑制Glut-1后可以抑制MRP1的表达,抑制Glut-1基因可能通过抑制MRP1基因及蛋白表达提高喉癌Hep-2细胞顺铂敏感性。