本文应用显微外科技术、荧光比例技术、共聚焦显微镜技术和细胞生物学等方法，从组织、细胞两个层次研究了小G蛋白亚家族RhoA的下游效应器Rho激酶在烧伤诱导的微血管通透性增高中的作用与机理。重点查明：1、烧伤后皮肤微血管通透性增高是否伴随内皮肌动蛋白细胞骨架重组；2、Rho激酶是否参与烧伤后皮肤微血管通透性增高和内皮肌动蛋白细胞骨架重组。 在组织水平的研究中，用游离灌注的烧伤后大鼠皮肤微静脉测定了微静脉对荧光标记白蛋白的通透性，荧光标记白蛋白通过血管壁的扩散通量以通透系数Pa表示。用F-actin特异的荧光探针罗丹明-鬼笔毒环肽对微静脉染色和激光共聚焦显微镜技术观察微静脉内皮肌动蛋白细胞骨架的改变。用Rho激酶特异抑制剂Y-27632药理学干预的方法以评估Rho激酶在烧伤诱导的内皮屏障功能损害中的作用。主要结果： 1、烫伤后皮肤微静脉通透性增高，Pa值为对照组的3倍，P＜0.01。 2、Y-27632对正常皮肤微静脉Pa值无明显影响，但使经烫伤后增高的皮肤微静脉通透性降低，呈现剂量和时间效应。血管浸浴液中加入Y-27632(30 μmol／L)，10～15min后Pa值开始逐渐下降，50min后，Pa降低值与基础值比较有统计学意义，(P＜0.05)。这种作用是可逆的，Y-27632撤离后，Pa值逐渐恢复，约30min后恢复至基础值。Y-27632浓度增加至60μmol／L，Pa值降低的幅度明显大于30μmol／L组。孵育20min后，Pa值明显地低于孵育前，并持续至90min；撤离Y-27632后，Pa值没有明显恢复。 3、正常大鼠皮肤微静脉内皮细胞F-actin位于细胞周边，细胞-细胞连接的附近，形成致密的纤维束，称之周边肌动蛋白纤维环(peripheral actin rim，PAR)，PAR沿细胞-细胞连接处规则而连续排列，相互交错成网。单个PAR的宽度约6～15μm，长度约10～40μm，细胞内有少量短的肌动蛋白丝。偶见肌动蛋白纤维环断裂，少量绿色荧光蛋白漏出。Rh口麟酶与烤份欢营通透趁 4、烫伤后皮肤微静脉内皮肌动蛋白细胞骨架发生重组。PARs解聚、断裂，规则的网状结构消失，部分肌动蛋白纤维向附近散开，血管内残留断裂的F一actin结节，大量荧光蛋白漏出。 5、烫伤后皮肤微静脉用丫27632(60卜mo比)37oe孵育40n五n后，内皮细胞PARs清晰可见，偶见断裂的PARs，仅少量荧光蛋白漏出，其结果与正常对照组相似。 在细胞水平的研究中，原代培养的大鼠皮肤微血管内皮细胞 (DMEC)和人类脐静脉内皮细胞ECV304细胞株按实验分组分别用大鼠对照血清、大鼠烧伤血清、RhoA激动剂溶血磷脂酸(LRA)、助。激酶抑制剂Y-27632单独处理或联合处理。用扫描电镜观察细胞表面超微结构，荧光染色观察(罗丹明一鬼笔毒环肤、俄勒冈绿一DNA酶DF一actin和G一actin，流式细胞仪检测actin含量，检测内皮单层通透性(荧光标记白蛋白透过融合的内皮单层的扩散通量)，以通透系数Pa表示。结果: 1、扫描电镜下，正常内皮细胞生长良好，表面有许多凹陷和微绒毛，细胞侧面的突起细而长，与相邻细胞侧面的小突起相互融合，紧密连接。烧伤血清刺激6h，细胞表面微绒毛被波浪状皱纹取代，细胞侧面突起变短，细胞间出现缝隙。烧伤血清刺激6h后，加丫27632(30卜mo讥)孵育45而n，细胞表面微绒毛与波浪状皱纹并存，细胞侧面突起细长，与相邻细胞相互融合，连接紧密。这些表现在DMEC与ECv-304细胞之间比较无明显差异。 2、正常大鼠DMECF一actin主要分布在细胞周边，形成周边肌动蛋白丝带，在细胞与细胞接触处呈束状相互连接，细胞生长融合为单层后呈网状结构。胞浆内有少量短而细的应力纤维。烧伤血清刺激6h，F-actin重组，丝状和板状伪足形成，出现粗而长的应力纤维，周边肌动蛋白丝带模糊甚至消失。延长烧伤血清刺激时间为sh，应力纤维进一步增加，周边肌动蛋白丝带消失。细胞与Y-27632(30卜m。比)单独孵育，周边肌动蛋白丝带变薄，但连续、光滑、清晰。在烧伤血清刺激6h或sh后，加入30卜伽比的丫27632孵育45而n，周边肌动蛋白丝带变细、断断续续、但清晰可见，应力纤维消失，出现丝状和板状伪足。其表现6h组与sh组比较无明显差异。细胞与丫27632(30林mo比)预孵育lh后再加烧伤血清刺激6h或sh后，可改善烧伤血清刺激诱导的F-actin改变，应力纤维形成明显减少，周边肌动蛋白丝带变细，但光滑、连续，出现丝足，一些细胞出现板状伪足。ECV-304细胞的反应与DMEC基本相似，但不及DMEC敏感。 3、正常DMEC单体肌动蛋白(G一actin)主要分布在胞核及核周处，烧伤血清和丫27632单独处理或联合处理均未能引起明显改变。ECV304细胞G一actin集聚在细胞中央，呈球形或梭形，棉絮状，中央部染色较淡，周边部着色稍深。烧伤血清刺激后，G一actin结构松散，向细胞周边扩散，分布面积增大，胞浆中可见散在分布的絮状G一actin。丫27632前处理或后处理均能改善烧伤血清诱导的G一actin形态改变，G一actin分布面积缩小，结构紧密，胞浆中散在分布的絮状G一actin明显减少。 4、DMECs，溶血磷脂酸(LPA，13林mo比)，)刺激引起F一aetin的改变主要表现为周边肌动蛋白丝带模糊，应力纤维增加，