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杂种优势是生物界的一种普遍现象,利用杂种优势可以显著地提高作物的产量和品质。许多研究和生产实践表明,小麦也和其他杂种作物一样具有明显的杂种优势,采用化学杂交剂诱导的小麦生理型雄性不育具有亲本选配自由,可以直接利用常规品种等优点来组配强优势组合,成为目前小麦杂种优势研究利用的主要途径之一。化学杂交剂SQ-1是一种新型化学杀雄剂,能够诱导小麦产生95%-100%的雄性不育,饱和授粉结实率可达到85%以上。在生产上,应用SQ-1已经组配出一批超高产、优质、多抗的杂交小麦新品种。然而,其诱导小麦雄性不育的机理尚不清楚,为了揭示小麦生理型雄性不育的分子机理,更好的为小麦杂种优势利用提供理论依据和技术支撑,本研究首先通过细胞学的方法对生理型雄性不育系花药中淀粉积累以及小孢子的细胞分裂等情况进行了观察;其次分析了生理型雄性不育系花药活性氧和抗氧化酶变化以及氧化损伤;然后,以TaPCNA基因作为研究的主体,采用RT-PCR方法扩增小麦TaPCNA基因序列,采用实时荧光定量PCR、原核表达技术和hiTAIL-PCR方法对该基因的表达及其分子特征进行了分析;最后,利用酵母双杂交技术筛选了TaPCNA的互作蛋白,并结合实时荧光定量PCR技术分析了这些蛋白基因的表达模式,进一步探讨了这些基因与花粉发育的关系。获得的主要结果及结论如下:1.与正常可育系相比,扫描电镜观察结果表明,生理型不育系花粉粒皱缩,形状不规则,小孢子细胞分裂出现异常,大部分小孢子细胞停止在单核和二核期不再分裂。2.活性氧代谢研究表明,生理型雄性不育系花药的O2?-、H2O2生产速率和MDA含量都显著高于正常可育系花药,而SOD、POD和CAT酶活性却显著低于正常可育系,活性氧含量的过多积累会使花药活性氧代谢严重失衡,并造成膜脂过氧化以及蛋白、核酸发生损伤甚至造成细胞死亡。DNA增色效应实验结果表明,生理型雄性不育系花药DNA增色效应增高,推测生理型雄性不育系花药DNA发生了断裂。筛选出6条扩增条带清晰、多态性高、重复性好的RAPD引物,用所选的6条引物对生理型雄性不育系和正常可育系花药基因组DNA进行扩增。结果表明,这6条引物在不育系和正常可育系间可扩增出差异条带,随机引物在基因组DNA上的特定结合位点被破坏,表现为RAPD扩增的DNA条带的增加或减少。由此说明,生理型雄性不育系花药DNA产生了损伤。3.以小麦花药为实验材料,利用反转录PCR(RT-PCR)克隆了小麦细胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因的cDNA序列,命名为TaPCNA(GenBank登录号:KM087781)。测序结果显示,小麦TaPCNA基因编码区为792 bp,编码263个氨基酸,分子量约为29.16kD,理论等电点为4.53。实时荧光定量PCR结果表明,TaPCNA在生理型不育系中表达量升高,而细胞周期G1/S期转换标志基因Histone H4基因在生理型不育系中表达下降。将得到的小麦TaPCNA基因片段连接到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,诱导的重组菌株与未经诱导的对照组相比,在相对分子量约50kD附近有明显的蛋白质表达条带。采用hiTAIL-PCR技术,获得TaPCNA基因起始密码子上游894 bp的启动子序列。PlantCARE启动子在线分析软件预测含有光应答调控元件(Box I)、脱落酸应答元件(ABRE)、花粉发育应答元件(GGTT motif,GTGA motif)及细胞周期转换结合位点(E2F-binding site)等顺式作用元件。然后,用TaPCNA基因启动子序列替换植物表达载体pBI121 GUS基因前的CaMV35S启动子,构建启动子融合表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导转化烟草(Nicotiana tabacum)叶片进行了瞬时表达分析,以GUS作为报告基因研究在SQ-1胁迫下启动子的活性。结果显示,SQ-1对TaPCNA基因启动子有明显的诱导激活效应。4.成功构建了酵母诱饵表达载体pGBK-TaPCNA,并验证了其在酵母细胞中没有毒性和自激活性。利用酵母双杂交系统筛选出6个与TaPCNA互作蛋白,这些候选蛋白主要参与细胞周期调控以及DNA损伤修复等。对TaPCNA互作蛋白基因的定量表达结果表明,DNA损伤修复基因TaKu70、TaXRCC1和TaFen-1在生理型雄性不育系中表达上调。细胞周期调控基因TaCycD2的表达在生理型雄性不育系中下降,而TaICK1的表达在生理型雄性不育系中上调。同时,采用双分子荧光互补技术在洋葱细胞中进一步验证TaPCNA与TaICK1之间的相互作用,结果表明在洋葱细胞的核内,TaPCNA相连的nYFP可与TaICK1相连的cYFP形成互补而产生荧光,证实它们之间在植物体内也具有相互作用。