转Bt基因抗虫水稻T51-1 (Tu et al.,2000)是一个结实率偏低和叶尖枯萎且叶色发黄的插入突变体,其旁侧序列分析证实该插入突变体中的外源Bt基因是插入在一个水稻内源类抗病基因Os10g0183000的启动子中,并位于该基因起始.密码子ATG上游797bp处(Lai et al.,2013)。由于T51-1相对原始非转基因受体亲本明恢63(MH63)最显著的特征是低结实率,因此将该基因命名为OsLSR(Low seed setting rate)。本研究以MH63为材料克隆了该基因,通过反向遗传学对OsLSR在水稻中的功能进行了分析和验证,着重分析了该基因的表达特性,基因及其各个结构域的功能,亚细胞定位和积累特性,以及蛋白质互作和信号传导途径。研究结果如下：(一) OsLSR的表达特性：实时荧光定量PCR分析发现OsLSR在水稻各个组织包括根,茎,叶,叶鞘,节,花中都有表达,且在水稻小花内部器官包括雌蕊,雄蕊,浆片中表达水平较高。将OsLSR的启动子连接GUS报告基因,进一步分析了该基因在水稻花序发育过程中的时空表达特性,发现其在水稻花发育过程中的表达涉及每一个器官而且具有明显的时序特点：起先只在小花枝梗分叉处表达；继而在雌蕊底部大量表达直至开花；随着花器官的发育,在早期幼嫩花药中高效表达,然后逐渐减弱消失；开花前,在花丝中的表达逐渐增强并达到峰值水平；临开花时则在浆片中大量表达。OsLSR的这种表达特性,表明OsLSR在水稻花器官发育和开花过程中,扮演着非常重要的角色。(二) OsLSR在水稻中的功能：序列比对表明,OsLSR基因具有植物NLR基因的典型特征；荧光定量PCR发现T51-1中OsLSR的表达量被上调,且所检测的免疫应答相关基因的表达量也出现了1.7-158倍不同程度的上升；将OsLSR在烟草中瞬时表达,诱导烟草细胞产生超敏反应；在水稻品种明恢63稳定过量表达OsLSR,转基因植株表现明显的生长弱势,且结实率显著下降；这些结果证实OsLSR基因编码细胞内免疫受体NLR蛋白,而T51-1生长弱势是由于OsLSR基因表达上调导致植株长期处于免疫激活状态所致。当利用RNAi技术抑制该基因的表达后,阳性愈伤的根系再生和生长受阻,且形态发生异常；至生殖生长阶段,部分分生组织确定性消失以致花器官分化发生紊乱；进一步通过过量表达OsLSR蛋白的不同功能域或片段,转基因植株均表现出不同程度的花发育缺陷；然而将OsLSR全长蛋白与核定位信号NLS和输出信号NES融合以改变其在水稻细胞中的原有分布状态,同样能引起花器官分化异常。这些结果因而进一步表明OsLSR基因参与了花器官的发育与分化。由此看来,OsLSR是一个既参与了水稻免疫反应调节又参与了其花器官发育与分化的基因。这是首次报道NLR蛋白影响水稻花器官建成的直接证据,因此增进了人们对NLR类基因功能的认识。(三) OsLSR的亚细胞分布和免疫应答模式：前人的研究业已表明植物NLR蛋白的亚细胞分布对其行使功能有着重要的影响。对此采用两种方法对OsLSR的亚细胞分布进行了研究。由于OsLSR蛋白的致死性,无法通过在烟草细胞的瞬时表达中来得到完整OsLSR蛋白的亚细胞分布。于是通过构建一系列OsLSR结构域截段和eGFPde融合表达载体,来研究它的亚细胞分布。结果发现LSR 1-178和LSR464-546两个截段的eGFP融合蛋白均表现出依赖蛋白丰度的细胞分布特性,即在低丰度的细胞中,均定位于叶绿体中,而在高丰度表达的细胞中,前者表现为在叶绿体、细胞核和细胞质中均有分布,而后者则只在细胞质中积累。联系到OsLSR蛋白的丰度与它的免疫激活程度有关,可以推断,OsLSR低丰度表达时,不被激活的OsLSR蛋白位于叶绿体中；但当OsLSR表达增加,OsLSR蛋白被激活,并随即从叶绿体转运到细胞质与细胞核中。进一步地,我们通过引入外源的核定位信号NLS和核输出信号NES来改变OsLSR在核内外的分布,以了解对其生物学功能有无影响。结果发现在烟草叶片中瞬时表达时,由于亚细胞积累特性的改变导致OsLSR诱导过敏性细胞死亡的能力减弱和NtPR1a表达水平降低；而在水稻中稳定表达时发现引入核定位信号NLS的转基因植株中的抗性标记基因的表达均高于引入核输出信号NES的转基因植株。另外,通过分析内源OsLSR的转录水平,我们还发现LSR::eGFPHLS能充分抑制其转录。这些结果因此说明细胞核内的OsLSR具有自身负反馈调解能力。由此看来,细胞质与细胞核中积累的OsLSR都参与了免疫应答信号传递,其中细胞核中积累的OsLSR对于诱导免疫应答时的转录重编程至关重要,并对自身表达具有负反馈调节作用,以免过于激烈的自免疫反应造成自我伤害。(四) OsLSR对下游基因的调控特性：以LSR1-178为诱饵蛋白,通过酵母双杂交筛选水稻cDNA文库,发现其与水稻亚硫酸盐氧化酶OsSO,和金属硫蛋白OsMT2b存在互作。通过实时荧光定量PCR检测它们在oSLSR于扰和过表达株系中的表达水平,发现oSLSR对这两个基因均是负调控。在oSLSR结构域超表植株中发现LSR1-178负责抑制作用,而LSR160-437和LSR464-894则促进了它们的表达。这与文献报道的osSO和oSMT2b参与了植物的抗病以及细胞死亡结果相一致,并且这两个基因表达异常均能阻碍水稻的生长发育。这些研究结果表明,oSLSR除了能诱导免疫应答和调控水稻小花分化外,还能通过调控oSMT2b和osSO的转录来调节细胞内环境,使得它们保持一个正常的转录水平,维持细胞内环境的稳定。综上所述,本项研究以T51-1及其受体亲本MH63为材料,阐明了水稻基因osLSR对水稻生长发育和抵御病害的作用及机理,解释了T51-1的生长弱势的原因。本项研究将水稻免疫应答和小花分化这两个过去被认为是相互独立的生理生化过程,通过osLSR在分子水平上建立了联系,拓宽了对NB-LRR蛋白功能的认知,为进一步交叉研究提供了新的启发和思路。