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NDRG2(N-Myc downstream regulated gene2)是首先由我们课题组发现并报道的抑癌候选基因。其首先发现在星形胶质细胞和胶质细胞瘤中存在差异表达,近年研究已明确其在十余种肿瘤中呈低表达,并有部分研究发现NDRG2可参与调控增殖信号通路、上皮-间充质转化及糖代谢发挥抑癌作用。但目前的机制研究仍较为有限,对NDRG2的具体功能仍不清楚。 利用免疫共沉淀和质谱技术可以鉴定到目标蛋白的相互作用蛋白,对推测蛋白功能,了解其参与的信号通路具有很好的指导作用。我们前期通过免疫共沉淀技术及质谱技术鉴定到NDRG2可与多种磷酸酶存在相互作用,并且含有多种周期调控蛋白。既往已有报道NDRG2可与蛋白磷酸酶2催化亚基α(protein phosphatase2 catalytic subunit alpha,PPP2CA)存在相互作用。故我们推测,NDRG2可能通过蛋白磷酸酶参与细胞周期的调控作用。 细胞周期是肿瘤研究的重点研究对象,其对肿瘤发生、增殖、凋亡及对化放疗敏感性都有极为重要的研究意义。正常细胞中存在G1/S期和G2/M期检查点,通过对DNA复制前和进入有丝分裂前基因组进行检查防止DNA损伤累积。当检查点功能受损,就会诱发细胞产生基因突变,甚至诱发癌变。在肿瘤细胞中,细胞周期检查点相关分子同时参与影响细胞对化放疗的敏感性。Polo样激酶1(Polo like kinase1,PLK1)通过激活Cdc25调控G2/M期检查点,其在多种肿瘤中存在过度活化和高表达,且利用RNAi技术干扰PLK1可以抑制细胞增殖,且其在P53突变或缺失的肿瘤细胞中具有较强的抑制作用。 丝/苏氨酸蛋白磷酸酶是调控细胞内磷酸化修饰的重要功能酶。真核细胞中存在500余种激酶,其中60%为丝/苏氨酸激酶,但仅有对应的40余种丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,故这些有限的磷酸酶可以通过不同机制对复杂底物实现去磷酸化。蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase,PP1)是细胞中极为经典的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,可参与细胞周期、糖原合成与分解、肌球蛋白修饰等生理过程。PP1在G2/M期通过对PLK1第210位苏氨酸去磷酸化抑制其功能,防止细胞逃逸检查点快速进入有丝分裂。 在肿瘤研究中,细胞系和裸鼠成瘤等经典的研究模型正面临越来越多的挑战,其真实性和可靠性也面临质疑。利用基因敲除小鼠进行在体功能和机制研究是目前较为稳定和可信的研究策略。本研究室既往已建立了Ndrg2-loxp小鼠、Ndrg2结肠特异敲除小鼠、Ndrg2全身敲除小鼠,为研究其机制提供了极好的模型工具。在本研究中,我们利用Ndrg2-loxp小鼠与P53-loxp小鼠进行杂交,筛选双纯合小鼠,再与含有星形胶质细胞特异启动子的GFAP-Cre小鼠杂交,实现小鼠在体星形胶质细胞中同时敲除Ndrg2与P53。因P53在肿瘤DNA损伤修复、细胞周期、凋亡和代谢中都有极为重要的调控作用,故该模型可帮助进一步明确NDRG2在多种肿瘤信号通路中的功能。 我们的研究表明,NDRG2可以通过募集PP1对PLK1去磷酸化,抑制其功能,导致Cyclin B表达下降,引起G2/M期阻滞,抑制细胞增殖。此外,通过Cre-loxp建立的Ndrg2与P53星形胶质细胞特异敲除小鼠可用于该作用机制的进一步模型验证。 目的: (1)阐明NDRG2在胶质细胞瘤中调控细胞周期G2/M期的具体机制。 (2)构建Ndrg2与P53星形胶质细胞特异敲除小鼠。 方法: (1)利用慢病毒介导的稳定表达技术,我们在U87MG、U251MG、T98MG中建立了NDRG2过表达细胞株。 (2)通过免疫共沉淀和质谱技术发现了NDRG2的相互作用蛋白,并进行截短体相互作用验证。 (3)利用流式细胞术和蛋白免疫印迹技术检测 NDRG2过表达对细胞周期的影响,并研究相关分子变化。 (4)利用Cre-loxp系统建立Ndrg2与P53星形胶质细胞特异敲除小鼠。 结果: (1)NDRG2在胶质细胞瘤中过表达可以引起细胞G2/M期阻滞,抑制细胞增殖。 (2)NDRG2可以与PPP1CC有相互作用,且该作用在G2/M期增强。 (3)NDRG2通过募集PPP1CC增强对PLK1的去磷酸化作用,使其第210位苏氨酸磷酸化下降,引起活性下降。 讨论:结合既往文献和本研究结果,NDRG2与多种蛋白磷酸酶有相互作用,提示其可能参与多种底物蛋白的磷酸化修饰,其具体作用方式和底物分子仍需要进一步研究。其对G2/M期检查点的调控作用提示其可影响化放疗敏感性,对临床治疗有较大研究价值。利用三种品系转基因小鼠建立的Ndrg2与P53星形胶质细胞特异敲除小鼠耗时较长,尚未能进行自发成瘤和功能研究,但该系小鼠将在胶质瘤发生进展研究中具有较好的研究价值。