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虾蟹壳废弃物是我国渔业废弃物的主要成分之一,不仅造成了资源的浪费也会带来严重的环境污染。几丁质是虾蟹壳组分中最具利用价值的成分之一,其降解产物在医药、食品、化妆品、农业等领域有着广泛的应用。几丁质酶能水解几丁质,因此,拓展几丁质酶基因资源,研究几丁质酶学性质具有一定的理论意义和应用价值。 本研究采用平板透明圈法和摇瓶法筛选获得了一株高产几丁质酶的细菌,通过细菌形态观察、生理生化检测和分子生物学实验对菌株进行了鉴定。在此基础上,对菌株产酶过程进行了分析。利用硫酸铵沉淀法、胶体几丁质亲和吸附法和DEAE-Sepharose FF凝胶吸附法对几丁质粗酶液进行了提纯,并研究了其酶学性质。最后,研究了超声波破碎、微波辐照和超微研磨破碎等预处理方式对虾壳粉一步酶法降解的影响。 本文的研究结论如下: (1)本研究筛选获得了一株高产几丁质酶细菌,经过鉴定,命名为Chitinibacter sp.GC72,目前保藏于中国典型培养物保藏中心。对该菌的发酵进程曲线进行了研究,证实其产酶在72 h左右达到最大值(0.91 U/mL),产几丁质酶过程体系pH值在中性左右,需要诱导剂粉粒几丁质的存在才能合成几丁质酶。 (2)通过硫酸铵分级沉淀、胶体几丁质亲和吸附和DEAE-Sepharose FF凝胶吸附三步法对菌株所产几丁质酶进行了纯化,获得了电泳级纯度几丁质酶。提纯回收率为28.1%,纯化倍数7.73,比酶活为21.88 U/mg。电泳结果证实该酶在活性条件下是双亚基结构,大小约为130 KDa。酶学性质研究结果表明,酶最适的反应温度和pH分别为40℃和6.8。具有良好的热稳定性和pH值稳定性。Al3+、Cu2+、Zn2+对酶活有较强的抑制作用,而 Ca2+、Mg2+、Fe2+对酶活则有促进作用。以对硝基苯N-乙酰氨基葡萄糖为底物进行的降解动力学分析结果表明,Km值为152.83μmol/L,Vm值为49.12μmol/L·min,反应活化能为67.82 KJ/mol。 (3)对降解产物进行了薄层板层析、液相检测和质谱检测。结果表明该几丁质酶对胶体几丁质和粉粒几丁质的最终降解产物均为N-乙酰氨基葡萄糖。酶解过程存在底物和产物抑制现象。通过向酶解体系中加入60%(v/v)正己烷,可实现酶活的显著提高和抑菌。分析了多种虾壳粉预处理方式对酶解的影响,最终采用先超微粉碎后超声破碎的虾壳粉预处理方式可以大幅提高单糖收率至72.25%,较未处理对照组提高了98%,接近达到直接以几丁质为底物的降解效果。