上颌窦底提升同期种植并行骨增量处理是上颌后区骨量不足的种植患者快速、有效的解决方案。目前常用的骨替代材料往往只有骨传导性,骨诱导性较弱,且吸收降解速率不一,短期内无法促进上颌窦内成骨及种植体周骨矿化。利用组织工程技术在骨替代材料中加入具有骨诱导能力的种子细胞和生长因子,可以改善骨替代材料的成骨能力和降解性能。牙本质非胶原蛋白(Dentin non-collagenous proteins,DNCPs)是由牙本质分泌的一组复合蛋白,包括牙本质特异性蛋白、矿化组织蛋白和各种生长因子,参与成骨微环境的组成,在骨形成和矿化过程中起到调节作用。本实验从犬牙齿中提取DNCPs,复合骨替代材料β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP),联合骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)构建新型组织工程骨,探索其体外成骨能力及在犬上颌窦底提升同期种植术的成骨效果。实验具体内容分为以下四个部分:实验一 β-TCP对BMSCs体外成骨的影响目的:目前,临床上常用的骨替代材料脱蛋白牛骨基质(Deproteinised bovine bone matrix,DBBM)在上颌窦内降解速率慢,新骨形成慢,短期内种植体周围不能形成足够的骨结合;人工合成骨替代材料β-TCP的三维多孔结构与松质骨相似,是较为理想的成骨空间结构。本部分实验在体外比较DBBM和β-TCP对BMSCs的成骨作用,为后续实验筛选合适的支架材料,并探索其促进BMSCs成骨分化的调节因子。方法:取大鼠骨髓体外分离、培养,分别接种至DBBM和β-TCP两种材料表面培养。扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)观察细胞在支架材料上的接种效果;结晶紫染色检测细胞黏附率;细胞增殖与毒性检测试剂(Cell counting kit-8,CCK8)检测细胞增殖能力;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测BMSCs的成骨分化能力;实时荧光逆转录-聚合酶链反应(Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)检测骨形成相关因子ALP、核心结合因子α1(Core-binding factor alpha1,Cbfa1)、骨钙素(Osteocalin,OCN)的mRNA表达;免疫印迹实验(Western blot,WB)检测ALP,Cbfa1,OCN的蛋白表达。使用短片段干扰核糖核酸(Small interfer RNA,siRNA)转染 BMSCs,沉默骨形成蛋白 1(Bone Morphogenetic Protein,BMP 1)基因,将沉默组和对照组细胞分别接种至β-TCP材料表面,检测骨形成相关因子ALP,Cbfa1,OCN基因和蛋白的相对表达水平。结果.:接种细胞24 h后,β-TCP组的细胞黏附率高于DBBM组(p<0.05);SEM观察显示两种材料均呈三维多孔结构,β-TCP材料孔径大于DBBM,BMSCs均可黏附于两种材料表面,细胞形态和附着方式未见明显差异;CCK8分析结果显示BMSCs在接种第1 d时,两组间无显著差异(p>0.05),至第3 d起β-TCP组细胞增殖效率高于DBBM组,差异具有统计学意义(p<0.05);ALP染色及活性结果显示,接种至两组材料的BMSCs中ALP的表达和活性均随时间显著增强,β-TCP组在各时间点ALP的表达和活性均高于DBBM组(p<0.05);Real-time RT-PCR 和 Western blot 结果显示 β-TCP 组较 DBBM 组更能上调骨形成相关因子ALP,Cbfa1,OCN的表达(p<0.01);将沉默BMP1基因的细胞株接种至β-TCP材料表面,骨形成相关因子ALP,Cbfa1,OCN的表达下调(p<0.01)。结论:与DBBM相比,β-TCP是BMSCs适宜的支架材料;BMP1是β-TCP促进BMSCs成骨分化的调节因子。实验二DNCPs对BMSCs体外成骨的影响目的:DNCPs是由牙本质分泌的一组非胶原蛋白,对骨和牙本质的形成起关键作用。目前DNCPs作为复合型生长因子用于组织工程骨报道较少,且DNCPs的成骨促进机制尚不明确。本部分实验探讨DNCPs对BMSCs成骨分化的作用,为后续实验提供生长因子。方法:从犬牙本质中提取DNCPs,通过Western blot检测分析DNCPs的成分。犬髂骨抽取骨髓,密度梯度离心法分离培养BMSCs。以10 pg/mL浓度的DNCPs诱导BMSCs,CCK8法检测细胞增殖能力;ALP染色及活性检测BMSCs的成骨分化能力;茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量检测分析BMSCs矿化能力;Real-time RT-PCR和Western blot检测核心结合因子2(Runt related transcription factor 2,RUNX2)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、I 型胶原(Collagen I,COL-1)的mRNA表达;Elisa试剂盒检测培养液中转化生长因子 1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的分泌水平;检测 TGF-β1 下游的磷酸化细胞信号转导分子pSmad3的表达水平,并采用抑制剂阻断Smad3磷酸化检测成骨相关因子表达水平,探索DNCPs促进成骨分化的信号通路。结果:Western blot结果显示DNCPs提取物可以表达矿化组织蛋白OPN和骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)、牙本质特异性蛋白牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1,DMP1)、生长因子 BMP 1。CCK8 结果显示加入 10 μg/mL 浓度的DNCPs实验组和对照组在相同时间点的差异没有统计学意义(p<0.05);诱导7 d和14 d的ALP染色及活性结果显示,DNCPs可以上调BMSCs中ALP的表达和活性,与对照组相比,组间差异和时间点差异均有统计学意义(p<0.01);诱导14 d和21 d的茜素红结果显示,DNCPs组在钙结节的数量和尺寸上均优于对照组,钙离子浓度也高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。Real-time RT-PCR 和 Western blot 结果显示,DNCPs 可以上调骨形成相关因子RUNX2,OPN,COL-1的表达(p<0.01)。机制分析结果显示,加入DNCPs的实验组中TGF-β1的浓度高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.01);Western blot结果显示DNCPs可以上调TGF-β1下游分子pSmad3的表达水平,与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.01);采用抑制剂SIS3阻断Smad3磷酸化后,DNCPs-SIS3组中骨形成相关因子的表达水平DNCPs组明显下调,差异具有统计学意义(p<0.01),与对照组相比差异没有统计学意义(p>0.05)。结论:DNCPs可以促进BMSCs的体外成骨分化;TGF-β1/Smad3信号通路是DNCPs促进成骨分化的信号通路。实验三DNCPs-β-TCP复合材料对BMSCs体外成骨的影响目的:将不同质量比的DNCPs与β-TCP复合,筛选蛋白与材料的最佳质量比。检测BMSCs接种在复合材料上的细胞相容性和成骨能力,为后续的犬上颌窦底提升同期种植动物实验提供复合材料。方法:采用混合冷冻干燥法制备DNCPs含量分别为2.5%,5%,10%的DNCPs-β-TCP复合材料。将复合材料置于模拟体液中,检测1～28d DNCPs的释放率,筛选最佳质量比的复合材料。将BMSCs接种至复合材料上,检测其黏附、增殖、分化能力;SABC-Cy3荧光染色观察细胞骨架形态;Real-time RT-PCR和Western blot检测成骨相关因子RUNX2,OPN,COL-1的表达水平。结果:体外模拟释放结果显示DNCPs-β-TCP复合材料前3d突释,至第10 d释放速率较高,然后逐渐减慢,至第28 d三种含量的复合材料内均有未释放的DNCPs;含量为5%的DNCPs-β-TCP复合材料体外释放效果最佳,至第28 d复合材料中仍有较高浓度的DNCPs。材料接种至复合材料表面培养结果显示,DNCPs-β-TCP复合材料与单纯β-TCP对照组在细胞的黏附、增殖、生长上无显著差异(p>0.05);DNCPs-β-TCP复合材料可以上调BMSCs的ALP活性,促进BMSCs分化,与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05);荧光染色可见BMSCs在实验组和对照组均生长良好,无显著差异;Real-time RT-PCR和Western blot结果显示,与单纯β-TCP相比,DNCPs-β-TCP复合材料可以上调骨形成相关因子RUNX2,OPN,COL-1的表达(p<0.01)。结论:β-TCP可以作为DNCPs的支架载体,5%含量的DNCPs-β-TCP复合材料体外释放效果最佳;DNCPs-β-TCP与BMSCs之间具有良好的细胞相容性,可以促进BMSCs的体外成骨分化。实验四DNCPs-β-TCP复合材料结合BMSCs在犬上颌窦底提升同期种植术中的成骨效果目的:评价DNCPs-β-TCP-BMSCs组织工程骨在犬上颂窦提升同期种植术中的成骨效果。方法:6只beagle犬均进行双侧上颌第一磨牙M1拔除,3 m后行上颌窦底提升同期种植术。设计双盲对照实验,每只beagle犬双侧上颌窦内分别植入实验组材料DNCPs-β-TCP-BMSCs组织工程骨及对照组材料β-TCP-BMSCs。分别于术中、术后6 w、术后3 m测量种植体颊侧、腭侧、近中、远中、垂直向五个位点的种植体稳定性指数(Implant stability quotient,ISQ);CT检查种植体骨结合情况及种植体骨界面的骨密度;组织学检测上颌窦腔内的成骨效果及种植体周的骨矿化效果;骨组织形态计量学检测种植体骨结合率。结果:ISQ值显示术后6 w,DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组呈缓慢上升趋势,β-TCP-BMSCs对照组呈下降趋势;术后3 m,实验组明显上升,ISQ值高达78.3±4.3,对照组缓慢上升,ISQ为58.7±7.9,差异具有统计学意义(p<0.01)。CT观察种植体骨结合良好,种植体周无明显放射线透射影,上颌窦内无异常影像;DNCPs-β-TCP-BMSCs 实验组种植体骨界面的 CT值显著高于β-TCP-BMSCs对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。取种植体周上颌窦内植骨材料中心位置骨组织进行脱钙切片 HE染色,结果可见DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组中骨基质排列致密、有序,骨组织成熟,骨髓腔中骨小梁粗大、成形;β-TCP-BMSCs对照组中骨基质排列无序,骨组织不成熟,骨髓腔内骨小梁稀少。带种植体的硬组织切片进行Masson染色,结果可见DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组中种植体螺纹周围多为红染的成熟骨组织,且骨小梁结构清晰,排列有序,可见多处骨髓腔;β-TCP-BMSCs对照组中种植体螺纹周围可见明显的蓝色编织骨条带,骨小梁排列不规则,罕见骨髓腔。骨组织形态计量学检测结果显示DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组种植体骨结合率显著高于β-TCP-BMSCs对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。结论:DNCPs-β-TCP-BMSCs组织工程骨可以促进犬上颌窦内早期成骨,促进种植体周围早期骨矿化。