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铜是生物体的一种必需微量元素,参与机体的许多代谢过程。它是许多重要酶的辅基成分,参与生长发育等一系列生物过程,其中包括铜/锌超氧化物歧化酶、细胞色素C氧化酶、赖氨酰氧化酶、铜蓝蛋白、酪氨酸酶,对羟基苯丙酮酸水解酶和多巴胺p羟化酶等等。生物体对铜的摄取主要通过饮食,特别是食物,为哺乳动物提供了大部分的铜来源。铜通过与氨基酸的螯合,在小肠黏膜吸收进入血液,并与白蛋白结合运输到各需要部位。铜主要存储于肝细胞,通过分泌释放到血浆或胆汁中。最受人们关注的是铜的缺乏症和中毒症,许多家养和野生动物都有铜缺乏的问题,同样也是人类所面临的问题之一,铜缺乏可造成动物机体贫血,免疫力和抗氧化能力低下。另一方面,铜也是一个氧化还原活性很强的过渡金属元素之一,可引发机体的氧化损伤,导致脂质过氧化,蛋白质变性和DNA突变,并可引起神经退行性疾病。到目前为止,还没有进一步的实验讨论铜与线粒体功能的关系,在本论文中,通过开展实验动物模型和细胞培养模型,从体内和体外两个方面讨论不同形式和剂量的铜对肉鸡肝脏及其线粒体功能的影响。
在饲养试验中,选用硫酸铜、三碱基氯化铜、蛋氨酸铜作为实验源铜,每种源铜均设四个浓度组,基础日粮对照组饲料铜含量为NRC(1994)推荐的11 mg/kg,三个试验高铜组分别为:110 mg/kg、220 mg/kg、330 mg/kg,360羽1日龄科宝商品代肉鸡随机分为12组,每组30羽,不同日粮相同条件下饲养60天,并于第12日龄、24日龄、36日龄、48日龄和60日龄分别取样5次进行相关实验,观察不同形式与剂量的日粮铜对肉鸡肝脏及其线粒体功能的影响;体外培养实验中以硫酸铜为实验源铜,选择0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L五个浓度对肉鸡肝细胞进行10 min刺激,并选择10 μmol/L的铜,对肝细胞进行5 min、10 min、15 min、20 min和30 min的刺激,观察铜对肉鸡肝细胞线粒体膜电位和细胞内游离钙浓度的影响,结果表明:
(1)三种源铜的饲料铜含量分别为110 mg/kg、220 mg/kg和330 mg/kg组的肉鸡体重在实验结束时均高于相应的对照组(11 mg/kg),差异显著(P<0.05),日粮铜浓度越高,肉鸡增重效果越好,GH水平越低,T3、T4浓度越高,其中以蛋氨酸铜作为源铜组的各项指标略优于相应的三碱基氯化各铜组和硫酸铜各组(P>0.05)。
(2)三种源铜各组的血常规及各项血液生化指标均在正常范围内,但随着日粮铜浓度的升高,红细胞数、血红蛋白含量呈现下降趋势,AST、ALT活性呈现上升趋势(P>0.05)。
(3)不同形式与剂量的铜日粮对肉鸡肝组织的铜沉积有明显的剂量与时间效应性,日粮铜浓度越高,时间越长,肝铜沉积越多,同一浓度的三种源铜对肝组织的铜沉积的贡献大小分别为:蛋氨酸铜>三碱基氯化铜>硫酸铜;肝脏组织切片和超微结构变化与肝组织的铜沉积表现一致,铜沉积越多,病理损伤越明显。
(4)本试验发现,日粮铜浓度为11 mg/kg和110 mg/kg时,随着饲养时间的延长,肝脏线粒体呼吸功能有增强的趋势,110 mg/kg实验组尤为明显。日粮铜浓度为220mg/kg和330 mg/kg时,在48日龄之前,肝脏线粒体呼吸功能也有增强的趋势,当饲养时间达到48天及以后,肝脏线粒体呼吸功能呈现下降趋势,特别是60日龄的330 mg/kg日粮铜浓度组;三种源铜的不同铜浓度组的肉鸡肝脏线粒体呼吸功能在实验前期(36日龄及以前),日粮铜浓度为11 mg/kg和110 mg/kg的实验各组以蛋氨酸铜组的呼吸功能最强。60日龄时,日粮铜浓度为110 mg/kg蛋氨酸铜组的呼吸功能最强,日粮铜浓度为220 mg/kg和330 mg/kg的肝脏线粒体的呼吸功能陆续下降,其次是三碱基氯化铜组和硫酸铜组。肝脏线粒体复合体Ⅰ~Ⅳ的活性与线粒体呼吸功能uo有一致的变化。
(5)线粒体H2O2生成速率与肝铜含量的变化有一致的趋势,铜含量越高,线粒体H2O2生成速率也越大,随着日粮铜浓度的增加和饲养时间的延长,线粒体H2O2生成速率也越大,有明显的剂量和时间依赖性。
(6)铜(Ⅱ)对肉鸡肝细胞线粒体膜电位和肝细胞内游离钙浓度的影响有剂量和时间依赖性,铜的浓度越高,时间越长,线粒体膜电位下降越大,并造成肝细胞内钙超载,肝细胞内游离钙浓度增加。