论文部分内容阅读
磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）作为一种新型的功能材料在近几十年来得到了充分的发展。特别是磁性复合粒子，它具有尺寸较小、比表面积大、表面活性高、生物相容性和流体稳定性好、比饱和磁化强度高及在外磁场作用下快速响应等优良特性。目前，在生物医学领域中应用广泛，给功能材料的研发带来了新的发展方向，也为生物分离和检测方法提出了新的思路。另外，化学发光具有安全、灵敏度高，线性范围宽等特点，为病原体检测提供了一个良好的平台。本论文的主要内容是以不同的方法制备磁性纳米粒子并以E.coli O157：H7和E.coli O157：H19为检测对象，结合磁分离技术、化学发光、PCR双重扩增的优点，建立了快速、灵敏和实用的多靶点检测新技术。具体内容包括：
1.以亚麻酸为改性剂的磁性纳米颗粒的制备
传统细微乳液聚合法制备磁性纳米颗粒的过程中，一般采用油酸为改性剂。在实验中我们发现，通过油酸（oleic acid，OA）和γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-Methacryloxypropyltrimethoxysilane，MPS）作为Fe3O4表面改性剂时，与甲基丙烯酸甲酯（methylmethacrylate，MMA）聚合耗时长，聚合过程中Fe3O4破乳团聚严重，有结块产生，包埋有单体的磁性颗粒产率低，而且修饰过程中有毒性。α-亚麻酸（α-Linolenic Acid，LNA）比OA多两个双键，更容易聚合，只需要5 h聚合时间，且无毒无害。我们首次用LNA同时作为Fe3O4表面改性剂和与MMA的交联剂，成功合成了聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）包埋的MNPs-PMMA/（LNA/Fe3O4）MNPs，并在其表面上修饰SiO2，得到了SiO2/（PMMA/LNA/Fe3O4）MNPs。由结果可知。制备出的MNPs具有明显的核壳结构，平均直径为500 nm，且为圆颗粒，大小比较均一，具有超顺磁性，饱和磁化强度为1.7374 emu/g。
2.软模板法制备SiO2/Fe3O4磁性纳米颗粒
以改进的软模板法制备Fe3O4微球并制备出了磁含量较高的SiO2/Fe3O4复合磁性颗粒。研究了反应时间和反应物对产物形貌的影响。结果表明，反应时间为12 h和反应物为NH4Ac时得到的产物形貌均匀且表面光滑，平均粒径约为300 nm，饱和磁化强度为78.505 emu/g。SiO2/Fe3O4磁性纳米颗粒的粒度范围为400-500 nm，且为圆颗粒，大小比较均一，具有超顺磁性，饱和磁化强度为43.274 emu/g。
3.基于MNPs和化学发光检测较长双链DNA的条件优化
以E.coli O157的特征基因为检测对象，设计了一种新的基于磁分离、PCR扩增和化学发光的核酸检测方法：将编码O157抗原基因rfbE的探针修饰固定在自制MNPs上。通过掺入生物素标记单体，利用PCR（Polymerase chain reaction）对样本DNA进行标记扩增，扩增的DNA片段与修饰在MNPs上的探针杂交后，在外磁场下分离除去非特异性吸附片段，与修饰有ALP的链亲合素（ALP-Streptavidin，ALP-SA）结合，洗涤后加入AMPPD，通过读取化学发光强度，实现E.coli O157的快速分析鉴定。实验最佳条件为：SA修饰MNPs的最佳浓度为1 mM；探针固定在MNPs上的最佳时间为12 h；杂交最佳时间为30 min；每mg MNPs上结合400 pmol探针时化学发光值最高。
4.基于磁性纳米颗粒富集、生物素信号放大和化学发光的DNA检测新方法的建立及应用
以E.coli O157：H7的特征基因为检测对象，在3中所述方法的基础上引入多重PCR扩增，方法如下：分别将编码O157抗原基因rfbE的探针和H7鞭毛抗原基fliC的探针修饰固定在MNPs上。通过掺入生物素标记单体，利用多重PCR（Multiplex polymerase chain reaction）对样本DNA进行标记扩增，扩增的DNA片段分别与修饰在上述两种MNPs上的探针杂交后，实验过程同3所述，实现了同时对E.coli O157：H72个靶点的快速分析鉴定。